3D生物打印技术(3D bio-printing technology)是在计算机的控制下，通过计算机辅助设计(CAD)和计算机辅助制造(CAM)，将种子细胞、生物材料和生物分子精准地在空间上排列，使之形成具有生物活性，且与目标组织或生物器官接近、相同，甚至功能更优越的组织或器官替代物^[1]。医生可以利用这种技术打印出患者损伤前的组织或器官，并移植到损伤部位，彻底修复损伤的部位。目前已可以利用3D生物打印技术成功打印出血管、皮肤、骨骼和牙齿等活体组织和器官。3D生物打印技术表现出的独特优势明显提高了目前的医疗水平^[2]。

1 3D生物打印的原理

3D打印的运作原理与传统的喷墨式打印机的工作原理基本相同，主要区别是3D打印机的喷头装置不仅能在水平面上移动还可以垂直移动。3D打印在计算机三维数模的驱动下，通过喷头装置将成型的材料喷射出来或对材料层喷射黏着剂等方式进行逐层积累，堆积建造，“打印”出与三维数模形状和尺寸完全一致的实体^[3]。目前，在生物医学领域，3D打印有2种打印思路：一种是先打印出具有生物相容性的支架材料，再将有活性的细胞组织种植到材料上形成细胞-材料复合体，然后将细胞-材料复合体植入组织缺损部位，生物材料在逐步降解的同时，种植的细胞不断增殖，从而达到修复组织缺损的目的^[4-6]；另一种是将细胞与支架材料直接混合打印，该种混合3D生物打印一般需要2个打印头，一个用于打印人体细胞，另一个用于打印细胞生长所需的支架，其支架材料的主要成分是含水的生物凝胶^[7]。因为3D生物打印所需的细胞由患者自身提供，所以移植后不会产生免疫排斥反应。

2 3D生物打印细胞

3D生物打印的细胞供体来源主要是患者自身^[8]。同时，在进行打印细胞之前，还需要对供体细胞的安全性进行筛查。供体安全性筛查主要包含一般安全性筛查和病原微生物检测^[9]。一般安全性筛查主要包括供体查体结果、身体状况询问、既往病史查询、家族遗传病学调查及出国时是否经过异体移植等。病原微生物检测主要通过实验室手段对供体进行检测，首先，对各种类型的供体组织细胞都应检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型及Ⅱ型(HIV-Ⅰ型及Ⅱ型)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和梅毒螺旋体。其次，对富含淋巴细胞及淋巴组织的供体，还应检测人T淋巴细胞病毒Ⅰ型及Ⅱ型(HTLV-Ⅰ型及Ⅱ型)；对于生殖细胞及组织供体，还应检测沙眼衣原体和奈瑟氏球菌。对于上述病原微生物检测，结果均为阴性才能作为种子细胞。

3 3D生物打印支架材料

目前，3D生物打印所需支架材料的来源大体可分为2类：一类是来源于动物和植物体内的天然生物材料，主要有胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、糖氨聚糖和纤维蛋白等^[10-11]；另一类是人工合成的生物材料，主要有聚α-羟基酸，包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨基酸和聚偶磷氮等^[12]。

生物支架是细胞黏附的基本框架，是细胞增殖分化的基本场所，是组织工程构建仿生组织和器官的基本支架。通过3D生物打印构建的支架材料必须具备以下条件^[13-15]：①具有良好的生物相容性，材料无毒，能够使细胞黏附，且不引起机体的免疫排斥反应；②具有良好的生物降解性，材料的降解速率与细胞的增殖速率保持一致，且降解产物对人体无害；③具有三维多孔结构，使营养物质和代谢废物能够顺利运输；④具有适当的机械强度，保证其为细胞生长提供支撑；⑤具有一定的可塑性，便于打印出所需要的形状和大小。

4 3D生物打印中的技术方法

目前在组织工程中，常用的3D生物打印技术主要有熔融沉积成型(fused deposition modeling，FDM)、光固化成型(stereo lithography apparatus，SLA)和选择性激光烧结(selective laser sintering，SLS)等技术^[16]。

4.1 FDM技术

FDM技术具有成本低、原料利用率高和后处理相对简单等优点，因此是目前应用最广泛的3D生物打印技术。首先，FDM的加热头把热熔性材料加热融化，使其成为流体状态，之后在计算机的控制下从3D打印机的喷头装置挤出，粘结到工作台上，然后快速冷却并凝固。每一层截面完成后，工作台下降一层高度，再继续进行下一层的造型。经过逐层沉积，最终形成所需要的实体造型^[17]。HONG等^[18]利用FDM技术打印出聚己内酯/聚乳酸复合材料，将材料移植到颅骨缺损大鼠模型中，一段时间后观察到骨组织有明显的再生。

4.2 SLA技术

SLA以光敏树脂为原料。打印时首先在液槽中盛满液态光敏树脂，之后通过紫外激光进行逐点扫描，使被扫描的区域薄层产生光聚合反应而固化，形成一个薄层。一层固化完毕后，工作台下移一层厚的距离，然后在原先固化好的树脂表面再敷上一层新的液态树脂，经过逐层扫描后，就可以打印出一个3D实体原型^[19]。在组织工程中，SLA常用的材料有聚乳酸、聚己内酯、蛋白质和多糖^[20]。

4.3 SLS技术

SLS是由WILLIAMS等^[21]在1989年发明的。其基本原理与SLA类似，采用激光逐层照射聚合物或金属粉末，使粉末熔融粘合，从而堆积成3D物体。在临床上，SLS技术常用于耳和鼻等缺损部位的打印。首先，用三维激光扫描仪对标准耳和鼻石膏模型进行扫描获得三维数据，然后用SLS将硅橡胶颗粒烧结出蜡模型并用高压蒸汽枪冲洗后填充硅橡胶，最后经染色就可以得到硅橡胶耳和鼻替代物^[22]。另外，在制药领域，因为SLS技术具有无支撑和可加工复杂内部结构等优点还常用于打印药物缓释装置。

5 3D生物打印的应用 5.1 3D打印血管

3D打印的血管组织具有独特的三维结构，从内到外依次为内膜、中膜和外膜，内膜主要由一层薄薄的内皮细胞构成，中膜由弹性组织、胶原和平滑肌构成，外膜由疏松的结缔组织组成。这种结构使天然形成的血管具有很好的弹性。组织工程中，理想的血管支架材料需要具有与天然血管相同的3层结构和性能^[23]。早在20世纪50年代，人造血管被成功制造出来，并广泛应用于大动脉血管的替换。但传统的人造血管在直径小于6mm以下的静脉血管制造上，一直没有取得突破性的进展^[24]。主要原因：人造毛细血管不仅需要足够细小，而且还要具有与天然血管一样的弹性和生物相容性，传统的人造血管在制备成小管径时无法同时保证其依然具有良好的弹性结构^[25]。然而，借助3D生物打印技术造出的毛细血管，是将患者身上采集的间充质干细胞和内皮细胞作为“墨汁”来源。LEE等^[26]利用打印机直接制造出了直径为1mm的血管组织，克服了小血管及毛细血管移植的难题。KANG等^[27]从恒河猴身体中取出约5g脂肪，提取出脂肪间充质干细胞制成3D生物打印所需的“墨汁”，再用特制设备打印出血管，并置换该猴体内一段约2cm的腹主动脉，术后1个月，打印血管已与恒河猴自身腹主动脉融为一体。同时，传统的人工血管存在内皮化问题，较易出现堵塞，约10年后就需更换。3D生物打印技术解决了该问题，打印的血管可终身使用。另外，移植传统人工血管的患者需终身使用抗凝剂，而3D打印血管将这一时间缩短到术后5d，此后无需任何药物治疗^[28]。

5.2 3D打印皮肤

由于目前医疗技术的限制，许多烧伤的患者在得到治疗后无法恢复到像原先一样正常的皮肤。同时，传统的皮肤移植多采用自体移植，该治疗手段只局限于较小的皮肤损伤，且自体移植需要患者承受二次外科手术的痛苦。打印皮肤的原理：首先选取一块健康的皮肤，利用3D生物打印技术诱导多功能干细胞增殖分化，然后让这些细胞作为“墨水”通过3D生物打印机打印出具有生物活性的皮肤。由于诱导再生的多功能干细胞来自患者自身，因此可以有效地避免免疫排斥反应^[29]。

目前，美国维克森林大学再生医学实验室研究出一种利用3D生物打印技术直接将皮肤细胞打印在损伤创面上的方法，该方法不仅适用于较大面积的皮肤损伤，同时也使患者避免了二次手术的痛苦^[30]。首先，3D生物打印机内置的激光器会对伤口的形状和尺寸进行测量，然后精确地将特定皮肤细胞打印在损伤的部位。目前在小鼠身上利用该方法进行的实验结果显示：通过3D生物打印技术修复损伤的部位可使其迅速而安全地愈合^[31]。

5.3 3D打印用于修复骨损伤

3D生物打印在骨组织损伤中修复的流程一般是先打印出仿生的支架材料，之后再把种子细胞种植到支架材料上形成细胞-支架材料复合体，最后将细胞-支架材料复合体植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。PATI等^[32]以PCL/PLGA/β-TCP为原料打印支架，并将人骨髓间充质干细胞植入支架材料中，随后将细胞-支架材料复合体植入小鼠骨缺损部位，一段时间后，植入了细胞-支架材料复合体的部位有大量类骨组织生成，缺损的部位几乎被完全修复。但是，目前3D打印出的支架材料与种子细胞植入缺损部位后，最终能够产生作用还要依靠血液循环系统运送营养物质和带走废物，而缺损部位血供建立失败不仅会使移入的细胞-支架材料复合体无效，反而会成为异物被机体免疫系统攻击。因此，将细胞-支架材料复合体植入骨损伤部位后，血管能否被诱导生成是骨组织损伤成功修复的必要条件。车鹏程等^[33]研究表明：利用物理共混技术和反复冷冻-解冻的方法，将聚乙烯醇和卡拉胶制作成的复合支架材料易于诱导损伤部位血管化的发生，该项研究为解决3D生物打印技术修复骨损伤的材料探索方面提供了新的思路。

5.4 3D打印与颌面修复

人体颌面骨的形状具有明显的个体差异，同时骨骼的外形直接影响人面部的外形及其工作性能。传统的通用型金属植入体不仅无法为患者提供具有个体化定制的外形骨替代物，而且由于不具有生物活性，植入体无法与邻接的人骨自然弥合和生长。3D打印技术与计算机CT图像处理技术近年来被运用于颌面骨畸形和缺损的修复领域，尤其在修复假体的形状匹配中具有独特的优势^[34]。3D生物打印技术在辅助颌面修复手术中有两方面的应用：一是为修复手术方案的设计提供实体模型，二是直接打印成型具有生物相容性的可植入假体。3D生物打印技术用于人体颌面部缺损修复手术，是目前3D打印技术在医学领域里比较有价值的临床应用。张庆福等^[35]利用3D打印技术，通过CT影像、三维重建、镜像、计算机辅助设计、生物力学分析及快速原型等多项技术的综合运用，在手术前即为患者设计制作了重量轻、生物相容性好和形态个体化的下颌骨修复体，通过手术置换，成功修复了患者下颌骨缺损。

5.5 3D打印器官

几年来，中国已成为年均器官移植数量仅次于美国的世界第2器官移植大国，中国每年能够成功完成肝脏移植2000多例和肾移植5000多例。然而，肝脏移植需求者以每年新增4000多例、肾脏移植需求者以每年新增1万多例的速度增长^[36]。同时，经过异体器官移植的患者要长期服用免疫抑制剂，患者术后生活质量也受到了严重的影响。3D生物打印技术的出现，让器官再造成为可能。

美国Organovo公司日前利用3D生物打印技术逐层打印了20层肝实质细胞和肝星状细胞2种主要的肝细胞，制作了微型肝脏器官。利用3D打印技术制作出的微型肝脏器官，虽然只有宽4mm、深0.5mm，但却具有天然肝脏的多项功能，能够进行血液过滤、运送营养物质和进行代谢，并且能够合成白蛋白、细胞色素P450和胆固醇。但是，天然的肝脏内有复杂的血管系统，而通过3D生物打印技术还无法完全打印出人工肝脏复杂的血管系统。因此，如何提高3D打印的精度成为研究者们急需解决的问题^[37]。另外，GAETANI等^[38]利用3D生物打印技术，将心祖细胞和透明质酸(hyaluronan)/水凝胶进行混合打印，成功制作出用于修复心肌梗死的补片。

6 展望

组织工程是3D生物打印技术目前最前沿的研究领域，已经在医学和生命科学领域引发了一场巨变。3D生物打印技术具有个性化制作、快速性、准确性及擅长制作复杂实体的特性，大大扩展了一些疾病的治疗前景，改变了传统组织工程的观念。尽管3D生物打印技术在组织工程领域应用起步较晚，但发展势头较猛，尤其伴随计算机技术的发展，3D生物打印过程中的分辨率和制造速度方面取得了重大进展^[39-40]。国内外医疗研究机构采用3D生物打印机已经成功打印出了皮肤、耳、肾脏、肝脏和血管等人体组织器官，但是挑战依然存在。目前的3D打印技术，在获取建立物体几何形状时几乎都是通过静态打印，但是对于一些活动的组织或器官就很难清晰地打印出来了。在制造过程中需要使用复杂界面系统的驱动，从而使多种材料得到精确的沉积。目前，3D生物打印还存在一些问题：①如何保持材料印刷性能的表征；②如何保证材料之间印刷参数具有兼容性；③制作过程中和制作后如何保持细胞的活力^[41]。但是，随着材料学和计算机技术的不断发展以及再生医学、组织工程和分子生物学领域研究的深入，3D生物打印技术可为组织修复和器官移植带来更加光明的前景。