蛋白翻译后修饰对蛋白功能的发挥起到了极为重要的调节作用^[1]。目前研究^[2-4]显示：小泛素样相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier protein，SUMO)修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种，与多种肿瘤的发生发展有密切关联。蛋白SUMO化与去SUMO化是一个动态可逆过程，SUMO化可能促进了人胶质瘤的发生^[5]，但去SUMO化在人胶质瘤组织和细胞中的作用尚不清楚。去SUMO化由SUMO特异性蛋白酶(SUMO-special proteases，SENPs)家族来完成。研究^[6-9]表明：SENPs与膀胱癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌的发生有关。但SENPs在人胶质瘤组织和细胞中的表达及作用鲜有报道。因此，本实验通过检测SENPs家族中SENP1、SENP2和SENP6在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达情况，初步探讨SENPs在人胶质瘤发生过程中的作用。

人正常脑组织(正常对照组)和恶性胶质瘤组织(恶性胶质瘤组)均由吉林大学第一医院神经外科提供。正常对照组患者8例，年龄45~73岁，平均年龄50.7岁，包括脑外伤3例和脑出血5例，均于死亡24 h内尸解取正常脑组织；恶性胶质瘤组患者10例，年龄49~71岁，平均年龄51.3岁，病理诊断均为Ⅲ-Ⅳ级恶性胶质瘤^{[5, 10]}，其中Ⅲ级胶质瘤5例，Ⅳ级胶质瘤5例，均于术后取恶性胶质瘤组织。Cos7细胞(正常细胞对照组)、LN443细胞和U343细胞(恶性胶质瘤细胞组)由吉林大学基础医学院提供。

SENP1和SENP2抗体购自美国IMGENEX公司，SENP6抗体购自美国ABGENT公司，BCA蛋白测定试剂盒和过硫酸铵购自美国Pierce公司。J-26XP超低温高速离心机购自美国贝克曼公司，超低温冰箱(MDF-U53V)购自日本三洋公司，PLUS 384全自动酶标仪购自美国MDC公司，DNA蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司，Image-Pro Plus图像分析管理系统购自美国Media Cybernetics公司。

将冻存的Cos7、LN443和U343细胞分别自液氮罐中取出，迅速置入37℃水浴中振荡5 min，离心后将细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液或1640培养液混匀，分别置于25 cm²培养瓶中，37℃、5%CO₂及饱和湿度下培养，隔日换液。倒置显微镜下观察细胞的形态表现。

准备组织或细胞，冰上破碎后加入50 μL细胞裂解液(裂解液含20nmol·L^－1蛋白抑制剂、20nmol·L^－1NEM和1%PMSF)，继续冰浴10 min，4℃、12000 g离心15 min，离心后弃沉淀，测定上清中样品的蛋白浓度，加入上样缓冲液，准备SDS-PAGE凝胶，上样跑胶分离样品，转膜后封闭1h，分别加入一抗SENP1、SENP2、SENP6和β-actin，4℃孵育过夜。次日二抗室温孵育1h，胶片曝光照相。结果采用Image-Pro Plus图像分析管理系统分析，以特异性条带平均吸光度(A)值与面积的乘积为有效值，代表蛋白表达水平。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。组织标本和细胞中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平以x±s表示，两组间样本均数比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组比较，恶性胶质瘤组恶性胶质瘤组织中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05)。见图 1和表 1。

Lane 1, 2: Normal control group; Lane 3, 4: Malignant glioma group. 图 1 SENP1、SENP2和SENP6蛋白在正常脑组织和恶性胶质瘤组织中表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of expressions of SENP1, SENP2 and SENP6 proteinsin normal brain tissue and malignant glioma tissue

图选项

与正常细胞对照组比较，恶性胶质瘤细胞组LN443细胞和U343细胞中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05)。见图 2和表 2。

Lane 1: Cos 7 cells; Lane 2: LN443 cells; Lane 3: U343 cells. 图 2 SENP1、SENP2和SENP6蛋白在正常细胞和恶性胶质瘤细胞中表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of expressions ofSENP1, SENP2 and SENP6 proteinsin normal cells and malignant glioma cells

图选项

目前，对哺乳动物细胞SENPs家族的6个成员中SENP1的研究较多。有研究^[11-12]表明：在前列腺癌形成过程中，SENP1mRNA和蛋白的表达水平均增加，SENP1可以通过调节基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达来影响前列腺癌细胞的转移能力。而在结肠癌中，SENP1则可以通过调控低氧诱导因子1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)途径来参与肿瘤血管的增生^[13]。在肺癌组织中，SENP1可以下调γ-H2AX蛋白表达而促进DNA损伤^[14]。也有研究^[15]表明：SENP1通过调控MMP9对胰腺导管癌的转移和侵袭能力发挥着重要的作用。ZHANG等^[16]发现：抑制胶质瘤细胞中SENP1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，降低细胞的侵袭和转移能力。本实验同时检测了恶性胶质瘤组织和细胞中SENP1蛋白的表达水平，结果表明：与正常对照组和正常细胞对照组比较，恶性胶质瘤组织和细胞中SENP1蛋白的表达水平均明显升高。在胶质瘤细胞中的表达结果与ZHANG等^[16]对胶质瘤细胞的研究结论一致，而在胶质瘤组织中的表达水平结果进一步验证了SENP1促进了胶质瘤的发生。因此，本研究在组织学和细胞学水平进一步验证了SENP1与胶质瘤发生的关系。

在蛋白的去SUMO化修饰过程中，SENP2也可能参与了肿瘤的形成过程。研究^[17]显示：膀胱癌T24细胞稳定表达SENP2时，细胞的增殖、侵袭和转移能力均明显降低，而SENP2低表达则可引起MMP13活化，从而促进肿瘤细胞的迁移。当肝癌HepG₂细胞和胃癌AGS细胞沉默SENP2表达时，反而促进了细胞的增殖及成瘤能力，深入研究^[18-19]显示：SENP2通过介导NDRG2肿瘤抑制基因或调控Wnt/β-catenin信号转导途径来影响肿瘤的发生发展。虽然SENP2在肝癌、胃癌和膀胱癌中可能有抗肿瘤形成的作用，但本研究结果显示：SENP2在恶性胶质瘤组织和细胞中的表达均明显升高。有关神经退行性病变的研究^[20]显示：SENP2表达下调或缺失会引起严重的神经功能障碍，而胶质瘤发生过程中会出现神经元功能的改变，这可能会引起SENP2的异常改变，从而导致SENP2的表达与其他肿瘤不一致。本研究结果显示：在胶质瘤的发生过程中SENP2可能起到了改变神经元功能的特殊作用，但其具体的作用机制还需要进一步的研究。

目前，SENP6在各种肿瘤发生中的作用还鲜有报道。研究^[21]显示：SENP6在肝细胞癌HepG₂细胞中高表达，沉默SENP6后如果用一定剂量的放射线作用于HepG₂细胞，则可引起核因子κB(NF-κB)活化水平增加并激活NF-κB通路，进而促进HepG₂细胞凋亡。本研究结果显示：SENP6在恶性胶质瘤组织和细胞中的表达水平均明显增加，提示SENP6可能对促进恶性胶质瘤的发生起到了重要的作用，但表达异常的SENP6调节恶性胶质瘤发生的具体机制尚不明确，仍需进一步深入研究。

综上所述，本研究检测了去SUMO化修饰蛋白SENPs家族成员SENP1、SENP2和SENP6在恶性胶质瘤组织和细胞中的表达水平，结果显示：在恶性胶质瘤组织和细胞中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显增加，提示SENP1、SENP2和SENP6可能对恶性胶质瘤的发生起到明显的促进作用。恶性胶质瘤发生时涉及了明显的蛋白SUMO化和去SUMO化，但究竟哪些蛋白发生了SUMO化或去SUMO化修饰改变，还需要更多的研究来进一步证明。