糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是由糖尿病导致的微血管并发症，主要因高血糖导致视网膜毛细血管壁出现渗漏等症状引起^[1]。中医学^[2]认为：糖尿病属于“消渴病”的范畴，以多饮、多尿、多食、消瘦、疲乏和尿甜为主要特征。在我国，DR的发生率为44.0%~51.3%^[3]。因此，找到一种有效预防和治疗糖尿病的方法一直是医学上的研究热点。菩人丹超微粉(简称PRD)具有益气生津、清解郁热的功效，主要药理作用为降脂和降糖，并且对糖尿病大血管病变具有保护作用^[4-5]。研究^[6-7]表明：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是调节视网膜新生血管形成的关键因素，在DR的发生发展过程中起重要作用。目前国内外关于PRD调节VEGF和bFGF的研究尚少。本研究结合血流动力学参数观察PRD对糖尿病大鼠视网膜VEGF和bFGF表达的影响，探讨PRD对改善糖尿病视网膜微血管病变的可能机制。

8周龄Wistar大鼠36只，体质量200~250g，由华北制药股份有限公司提供，动物许可证号：SYXK(冀)2015-0039，适应性饲养2周。链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, 美国Sigma公司)溶于0.1 mol·L^-1、pH4.4的柠檬酸盐缓冲液中，配置成10 g·L^-1的溶液；兔抗大鼠VEGF和bFGF抗体(北京博尔森公司)；VEGF和bFGF mRNA试剂盒(上海生工生物工程公司)；PRD(河北以岭药业集团有限公司)。

36只大鼠随机分为对照组、糖尿病组和PRD组，造模前测定大鼠体质量和血糖。糖尿病组和PRD组大鼠腹腔注射STZ溶液(65 mg·kg^-1)，对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液。于注射后72h尾部取血测定血糖，以血糖≥16.70 mol·L^-1为造模成功。造模后PRD组大鼠灌胃给予PRD(剂量为1.8 g·kg^-1)，对照组和糖尿病组大鼠灌胃给予等体积的生理盐水，每日1次，连续给药3个月。各组大鼠自由摄食饮水。

各组大鼠称体质量，测尿量，尾静脉采血，采用美国One TouchⅡ血糖仪检测血糖。脱臼处死大鼠后迅速取眼球于-80℃下保存，取出肝脏和两侧肾脏称质量。按以下公式计算肝、肾指数：脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。

各组大鼠于末次给药后腹腔注射戊巴比妥钠30 mg·kg^-1麻醉，采用彩色多谱勒超声诊断仪，15 MHz探头检测大鼠CRA，将探头置于大鼠眼睑上，启动彩色多普勒超声诊断仪，在获取5个以上稳定心动周期后，检测峰值血流速度(PSV)、舒张期最低流速(EDV)和平均流速(MV)，计算阻力指数(RI)和搏动指数(PI)，计算公式：RI=(PSV-EDV)/PSV，PI=(PSV-EDV)/MV^[9]。

取分离的视网膜组织，置于液氮中打碎，按照Trizol说明书提取视网膜总RNA，经检测总RNA完整未被污染，取3 μL总RNA进行逆转录(RT)，RT反应条件：30℃、10 min，55℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。PCR反应条件：94℃、2 min；94℃、30 s，50℃~65℃、30s；72℃；1 min。反应后取最终产物10 μL经过1.2%琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为内参，计算VEGF和bFGF与β-actin灰度值的比值，表示VEGF和bFGF mRNA表达水平。

bFGF引物序列：上游引物5′-GGCTTCTTCCTGCGCATCCA-3′，下游引物5′-GCTCTTAGCAGACATTGGAAGA-3′，57℃退火，35个循环，产物大小为374bp；VEGF引物序列：上游引物5′-GCGGGCTGCTGCAATG-3′，下游引物5′-TGCAACGCGAGTCTGTGTTT-3′，55℃退火，33个循环，扩增片段长度为183 bp；β-actin引物序列：上游引物5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游引物5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′，56℃退火，30个循环，扩增片段长度为510bp；

取各组大鼠眼球，冰浴中细心分离视网膜，去除角膜、晶状体和玻璃体，取出视网膜组织，连续切片，片厚4μm，加入一抗(1:100)，采用DAB显色，苏木素复染细胞核，阴性对照为0.01 mmol·L^-1PBS代替一抗。采用阳性细胞半定量法，胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性表达细胞，每个切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，取平均值。阳性细胞数 < 5%为(-)，5%~15%为(+)，16%~50%为(╫)，大于50%为()。采用BioMias图像分析软件测定阳性细胞平均灰度值，灰度值与阳性细胞的总量成反比，灰度值越大则阳性表达强度越弱。

取分离的视网膜组织，提取蛋白质，以BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度，蛋白上样量为50 μg，12%SDS-PAGE凝胶电泳2h，移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉TBST封闭2h；分别加入VEGF和bFGF抗体(1:200)，4℃过夜，洗膜后加入二抗辣根过氧化物酶(HRP)交联物室温下摇床孵育1h，采用Super ECL Plus超敏发光液显影，对显影条带进行分析，以VEGF和bFGF条带与β-actin条带的灰度比值作为目的蛋白相对表达水平。

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量、血糖、尿量、肝指数、肾指数、血流动力学参数、VEGF和bFGF mRNA及蛋白表达水平均以x ±s表示，数据符合正态分布且方差齐性，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与对照组比较，糖尿病组大鼠体质量明显降低(P < 0.05)，血糖、尿量、肝指数和肾指数明显升高(P < 0.05)；与糖尿病组比较，PRD组大鼠体质量明显增加(P < 0.05)，血糖、尿量、肝指数和肾指数明显降低(P < 0.05)。见表 1。

与对照组比较，模型组大鼠CRA的PSV、EDV和MV均明显降低(P < 0.05)，RI和PI明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，PRD组大鼠CRA的PSV、EDV和MV均明显升高(P < 0.05)，RI和PI明显降低(P < 0.05)。见表 2。

与对照组比较，糖尿病组大鼠视网膜VEGF和bFGF mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)；与糖尿病组比较，PRD组大鼠视网膜VEGF和bFGF mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)。见图 1、2和表 3。

M: Marker DL2000; Lane 1: Control group; Lane 2: Diabetes group; Lane 3: PRD group. 图 1 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜组织中VEGF mRNA表达电泳图 Fig. 1 Electrophoregram of VEGF mRNA in retina tissue of rats in various groups detected with RT-PCR

图选项

M: Marker DL2000; Lane 1: Control group; Lane 2: Diabetic group; Lane 3: PRD group. 图 2 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜组织中bFGF mRNA表达电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of bFGF mRNA in retina tissue of rats in various groups detected with RT-PCR

图选项

免疫组织化学染色结果显示：与对照组比较，糖尿病组大鼠视网膜内核层和神经节细胞层VEGF和bFGF蛋白呈阳性表达，阳性细胞数量明显增加(P < 0.05)，灰度值比值明显降低(P < 0.05)；与糖尿病组比较，PRD组大鼠VEGF和bFGF蛋白阳性细胞数量明显降低(P < 0.05)，灰度值比值明显升高(P < 0.05)。见图 3（插页三）和表 4。Western blotting检测结果显示：与对照组比较，糖尿病组大鼠VEGF和bFGF蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，PRD组大鼠VEGF和bFGF蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。见图 4和表 5。

A, D: Control group; B, E: Diabetes group; C, F: PRD group; A-C: VEGF protein; D-F: BFGF protein. 图 3 免疫组织化学染色检测各组大鼠视网膜组织中VEGF和bFGF蛋白表达(×400) Fig. 3 Expressions of VEGF and bFGF proteins in retina tissue of rats in various groups detected by immunohistochemstry staining (×400)

图选项

表 4 各组大鼠视网膜组织VEGF和bFGF蛋白半定量结果和灰度值 Tab. 4 Semiquantitative results and gray valuesof VEGF and bFGF proteins in retina tissueof ratsin various groups

Group	n	VEGF						bFGF
		-	+	╫		Gray value		-	+	╫		Gray value
Control	12	11	1	0	0	134.68±8.97		10	2	0	0	126.28±10.52
Diabetes	9	1	2	5	1	110.25±6.84*		0	2	5	2	105.35±9.51*
PRD	12	10	2	0	0	118.12±5.24△		9	2	1	0	114.37±6.42△
*P < 0.05compared with control group; △P < 0.05 compared with diabetes group.

表选项

Lane 1: Control group; Lane 2: Diabetes group; Lane 3: PRD group. 图 4 Western blotting法检测各组大鼠视网膜组织中VEGF和bFGF蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of VEGF and bFGF proteins in retina tissue of rats in various groups detected with Western blotting method

图选项

中医理论认为：DR的主要发病机制为气虚血滞，津液损耗所致。气虚引起人体帅血无力，血流凝滞不畅，津液损耗则导致脉道失润，血行涩滞，最终产生血瘀，引起毛细血管病变。中医对DR的治疗原则为益气、养阴和化瘀^[10-11]。PRD由苦瓜、人参、丹参、制首乌、葛根和水蛭等组成，具有益气养阴、清热和活血化瘀通络之功效。近年来，PED在治疗糖尿病相关疾病方面具有一定疗效^{[5, 12]}。

本研究结果显示：糖尿病组大鼠体质量下降，尿量和血糖增高，与糖尿病多饮、多尿、吸收减少、体质量下降的特征相符；另外，大鼠肝指数和肾指数明显增加，可能与肝肾损伤和炎症充血水肿有关，与糖尿病大鼠体质量降低也有一定联系，给药后PRD组大鼠肝指数和肾指数明显下降；PRD组大鼠体质量较糖尿病组升高，尿量和血糖有所下降，与前期研究中PRD能改善糖尿病大鼠血糖升高结果一致^[13]。

DR的发生对患者眼动脉血流动力学有一定影响，血流动力学参数中，PSV能够反映血管充盈度和血流供应程度，EDV为远端组织血液灌注状态，MD为远端血管阻力敏感性指标，RI和PI评价远端血管床阻力大小。本研究中多普勒超声检测结果显示：糖尿病组大鼠CRA的PSV、EDV和MV较对照组大鼠降低，RI和PI较对照组大鼠升高，与糖尿病患者临床结果相似^[14]。本研究结果显示：PRD组大鼠CRA的PSV、EDV和MV增加，RI和PI降低，可能与PRD降低血糖，从而降低血液黏度，使血液流速和视网膜血灌注量增加有关。研究^[15]表明：视网膜血流量减少可引起视网膜缺血缺氧，从而诱发视网膜新生血管的形成。新生血管的形成受到多个细胞因子的调控，如VEGF和bFGF等，这些细胞因子与DR的发生有着密切联系。VEGF能够特异地作用于血管内皮细胞，促进细胞分裂增殖^[16]，对新生血管的形成是必需的。bFGF是一种促进新生血管形成的生长因子，通过上调VEGF促进血管内皮细胞增殖，能够诱导内皮细胞产生细胞因子，促进毛细血管内皮细胞的迁移形成胶原基质，促进毛细管状微管形成，最终生成新生血管^[17-18]。VEGF和bFGF在微血管形成的过程中有协同增强的作用^[19-20]。本研究结果显示：糖尿病组大鼠视网膜组织中VEGF和bFGF表达水平明显高于对照组，与DR视网膜血流量减少，导致视网膜缺氧有关^[21]；与糖尿病组比较，PRD组大鼠视网膜组织中VEGF与bFGF表达水平降低，说明PRD能够改善视网膜血流灌注量，恢复视网膜血液供应，从而降低VEGF与bFGF表达水平。

综上所述，PRD可通过降低血糖水平，降低血液黏度，增加视网膜血流量和视网膜组织血供，从而增加微循环血液灌注量，降低血管床灌注阻力，改善视网膜的微循环，对糖尿病视网膜病变起保护作用。