2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 王秀艳, 樊晨星, 赵千, 王博, 袁松, 李昆
- WANG Xiuyan, FAN Chenxing, ZHAO Qian, WANG Bo, YUAN Song, LI Kun
- 丹参酮ⅡA对人胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导作用及其机制
- Induction of tanshinone ⅡA on differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(01): 33-38
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(01): 33-38
- 10.13481/j.1671-587x.20190107
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-30
缺血性心脏病是最常见的心血管系统疾病，其发病率和死亡率逐年增加，并呈年轻化趋势，对人类的健康造成了严重的威胁[1]。成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌缺血会造成心肌细胞不可逆损伤，于损伤处形成瘢痕，严重影响心功能[2]。目前，药物治疗、介入治疗和外科搭桥等传统治疗方法虽能改善心肌缺血症状，但不能弥补丢失的心肌细胞，部分患者最终发展为心力衰竭，甚至死亡[3-4]。近年来，干细胞移植已逐渐成为心血管系统疾病治疗中的研究热点。目前，心肌再生研究常用的干细胞主要是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，但心血管疾病在中老年人中发病率较高，而这些患者骨髓中BMSCs数量极少，限制了BMSCs在缺血性心脏病中的临床应用。人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPDMSCs)由于来源广泛、免疫原性较低，且能够体外大量扩增[5-7]而成为理想的可替代细胞。丹参酮ⅡA(TanⅡA)作为丹参的重要单体成分，临床上常用于缺血性心脏病的治疗。本研究采用TanⅡA干预hPDMSCs，观察其对hPDMSCs向心肌细胞分化的影响，探讨其相关作用机制，以期寻找高效低毒的心肌细胞分化诱导剂。
1 材料与方法 1.1 材料TanⅡA粉末(20mg，纯度≥98%)，购于上海江莱生物科技有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)配成贮存液，－20℃冰箱保存，实验时用低糖DMEM培养基稀释成目的浓度。胎牛血清、低糖DMEM培养基和青、链霉素购于美国Gibco公司，抗CD13、抗CD73、抗CD90、抗CD166、抗HLA-DR、抗CD14、抗CD29、抗CD31、抗CD44、抗CD45、抗CD105和抗HLA-ABC抗体均购于美国BD Biosciences公司，抗α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin，α-SCA)、抗心肌转录调节因子4(GATA-binding protein 4，GATA4)、抗心钠素(atrial natriuretic factor，ANF)、抗心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、抗糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和抗β-连环蛋白(β-catenin)抗体均购于美国Abcam公司。SDS-PAGE凝胶试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2 hPDMSCs的分离和鉴定采用组织分离细胞培养方法获得hPDMSCs[8]，37℃、5%CO2孵育箱中培养，每2d换液1次，取第3~4代细胞用于实验。细胞长满培养皿后用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化处理，PBS洗涤2次，加预稀释的PE标记的鼠抗人的CD13、CD73、CD90、CD166、HLA-DR抗体和FITC标记的鼠抗人CD14、CD29、CD31、CD44、CD45、CD105和HLA-ABC抗体于冰上避光孵育20 min，再加入400μL PBS重悬细胞，设置空白对照组，采用流式细胞术检测细胞抗原的表达。空白对照组各抗原表达均为阴性，通过与空白对照组的比较确定细胞抗原的表达。
1.3 MTT法检测hPDMSCs增殖活性用低糖DMEM培养基将TanⅡA稀释成不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg·L-1)，取对数生长期hPDMSCs，调整细胞密度为1×104mL-1，按100μL/孔铺于96孔板中，分别用不同浓度TanⅡA处理细胞，4d后MTT法检测hPDMSCs存活率。MTT法检测结果显示：TanⅡA < 0.1 mg·L-1时对细胞的生长无明显影响。为了更好地评估TanⅡA对hPDMSCs分化的影响，选用0.1 mg·L-1的TanⅡA进行实验。将hPDMSCs以6×103 mL－1密度接种于96孔板内，分为对照组、5-氮胞苷(5-aza)诱导组和TanⅡA诱导组，对照组加等量的培养基，5-aza诱导组加10μmol·L-1的5-aza，TanⅡA诱导组加0.1 mg·L-1的TanⅡA，其中5-aza诱导组在诱导24h后弃去培养液，换为10%低糖DMEM培养基，各组细胞4d换液1次，培养20 d终止实验，MTT法检测各组细胞吸光度(A)值，代表细胞增殖活性。
1.4 免疫组织化学法检测细胞中α-SCA的表达于培养20d后收集各组细胞，在4%多聚甲醛中室温固定20 min，PBS洗涤3次，用0.2%Triton X-100透化细胞10 min，在血清中室温封闭5 min，加入抗α-SCA抗体(1:100稀释)4℃孵育过夜。PBS充分洗涤，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(1:100稀释)室温孵育1h，PBS充分洗涤，苏木精染核。普通光学显微镜下分析染色结果，观察α-SCA染色呈阳性的细胞数量。
1.5 免疫荧光法检测心肌细胞分化率各组细胞于培养20d后收集，在4%多聚甲醛中室温固定30 min，PBS洗涤3次，用0.2% Triton X-100透化细胞10 min，PBS洗涤3次，在无血清封闭液中室温封闭5 min，加入抗cTnI抗体(1:50稀释)4℃孵育过夜，PBS充分洗涤，加入FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(1:50稀释)室温孵育1h，PBS充分洗涤，DAPI染核10 min。荧光显微镜下计数中央及四周5个视野的cTnI阳性表达细胞，取平均值。心肌细胞分化率=cTnI阳性表达细胞数/视野下总的细胞数×100%[9]。
1.6 Westernblotting法检测各组细胞中GATA4、ANF、cTnI、GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平各组细胞于培养20d后收集，PBS洗涤2次，冰上裂解30 min，12000r·min-1、4℃离心25 min后提取总蛋白，测定相应蛋白浓度并稀释至相同终浓度。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜，封闭1h，加入抗GAPDH、抗GATA4、抗ANF、抗cTnI、抗GSK-3β和抗β-catenin抗体，4℃摇床过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1h。用增强的化学发光检测试剂盒显色，自动电泳凝胶成像分析仪采集图像，以目的蛋白与GAPDH条带A值的比值表示目的蛋白表达水平。
1.7 统计学分析采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中GATA4、ANF、cTnI、GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平符合正态分布，均以x±s表示，2组间样本均数比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 hPDMSCs的生物学特性培养3 d时，有少量短梭形细胞沿组织块周边爬出；5d时，短梭形细胞有所增多；随着细胞缓慢生长，逐渐长成长梭形，类似成纤维细胞，并形成集落；培养至20d左右，细胞已达到80%~90%融合；传代后细胞又重新长成成纤维状细胞并形成集落(图 1，见插页二)。流式细胞术检测结果显示：人胎盘来源细胞的CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC表达阳性，而CD14、CD31、CD45和HLA-DR表达阴性(图 2)，与之前报道过的骨髓和脐血来源的间充质干细胞抗原表达相同[10]。
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| A:Primary culture for 3 d; B:Primary culture for 5 d; C:Primary culture for 20 d; D:Second generation. 图 1 培养不同时间hPDMSCs的形态表现(×100) Fig. 1 Morphology of hPDMSCs cultured for different time(×100) |
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| 图 2 hPDMSCs的流式细胞术检测结果 Fig. 2 Detection results of flow cytometry of hPDMSCs |
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MTT结果显示：TanⅡA < 0.1 mg·L-1时对细胞的生长无明显影响(图 3)。为更好地评估TanⅡA对hPDMSCs分化的影响，选用0.1 mg·L-1的TanⅡA进行实验。对照组细胞在培养12d前保持较快的增长速度并保持成纤维细胞样形态，培养12d后由于细胞密度增大，细胞出现接触性抑制，细胞增殖活性降低。与对照组比较，5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05)(图 4)。5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞以较慢的速度生长，有些细胞形态开始出现变化，逐渐增大形成棒状外观，在培养20 d时，细胞间出现很多连接细胞的分支，以TanⅡA诱导组效果最明显(图 5)。
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| 图 3 MTT法检测细胞存活率 Fig. 3 Survival rates of cells detected by MTT method |
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| *P < 0.05 compared with control group. 图 4 各组细胞增殖活性 Fig. 4 Cell proliferation activities in various groups |
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| A:Control group; B:5-Aza induction group; C:TanⅡA induction group. 图 5 各组hPDMSCs形态表现(×200) Fig. 5 Morphology of hPDMSCs in various groups(×200) |
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免疫组织化学结果显示：对照组细胞不表达α-SCA，5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞均表达α-SCA，但以TanⅡA诱导组效果更明显(图 6，见插页二)。
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| A:Control group; B:5-Aza induction group; C:Tan ⅡAinduction group. 图 6 免疫组织化学染色检测各组细胞中α-SCA的表达(×200) Fig. 6 Expression of α-SCAin cells in various groups detected by immunohistochemstry staining(×200) |
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免疫荧光检测结果显示：对照组细胞不表达cTnI，5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞cTnI表达阳性，但以TanⅡA诱导组效果更明显(图 7，见插页二)。各组心肌细胞分化率：对照组为0，5-aza诱导组为23%，TanⅡA诱导组为30%，TanⅡA诱导组心肌细胞分化率高于对照组和5-aza诱导组。
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| A:Control group; B:5-Aza induction group; C:TanⅡA induction group. 图 7 免疫荧光染色检测各组细胞中cTnI的表达(×200) Fig. 7 Expressions of cTnI in cells in various groups detected by immunofluorescence staining(×200) |
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与对照组比较，5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞中GATA4、ANF和cTnI蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05);与5-aza诱导组比较，TanⅡA诱导组GATA4和ANF表达水平进一步升高(P < 0.05)，cTnI蛋白表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 8。
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| Lane1:Control group; Lane2:5-Aza induction group; Lane3:TanⅡA induction group.*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with 5-aza induction group. 图 8 各组细胞中心肌特征性蛋白表达电泳图(A)和直条图(B) Fig. 8 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of myocardial characteristic proteins in cells in various groups |
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与对照组比较，5-aza诱导组和TanⅡA诱导组GSK-3β蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05)，β-catenin蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；与5-aza诱导组比较，TanⅡA诱导组GSK-3β蛋白表达水平进一步升高(P < 0.05)，而β-catenin蛋白表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 9。
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| Lane 1:Control group; Lane 2:5-Aza induction group; Lane 3:TanⅡA induction group.*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with 5-aza induction group. 图 9 各组细胞中GSK-3β和β-catenin蛋白表达电泳图(A)和直条图(B) Fig. 9 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions GSK-3β and β-catenin proteins in cells in various groups |
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干细胞分化为心肌细胞是一个复杂的过程，需要多种信号通路的调节[11]。cTnI是心室和心房细胞中典型的蛋白，在细胞分化早期表达水平低，细胞分化中晚期表达水平升高，是心肌细胞重要的特征性蛋白[12]。GATA4是心脏基因表达的重要转录调节因子，通过与其他转录调节因子相互作用，共同调控心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程[13-14]。在心肌细胞分化早期，GATA4即有表达，并通过激活ANF等的表达，促进心肌细胞进一步分化和发育[12]。
5-aza是目前公认最常用也是最有效的心肌细胞分化诱导剂，但其细胞毒性作用使之不能广泛应用于临床。目前，一般认为10μmol·L-1、作用时间为24 h是5-aza的最佳诱导条件[15]，但诱导效率低下。因此寻求一种更安全而有效的诱导剂成为该领域亟待解决的难题。
Tan ⅡA是我国传统中药丹参的有效活性成分。现代药理学研究[16-19]显示：Tan ⅡA能改善缺血区微循环，抑制血小板聚集和炎症反应，降低血脂，抑制动脉硬化的进展。本研究用Tan ⅡA干预hPDMSCs，观察其对hPDMSCs分化的影响，另设置不加药的阴性对照组和5-aza诱导(10μmol·L-1)的阳性对照组，结果显示：5-aza和Tan ⅡA均能使hPDMSCs增殖速率明显减慢，细胞形态也由成纤维细胞样形态变成短梭形样，心肌细胞特征性蛋白α-SCA、GATA4、ANF和cTnI表达水平均升高，提示5-aza和Tan ⅡA均能诱导hPDMSCs分化为心肌细胞，但以TanⅡA诱导组效果更明显。Wnt信号通路普遍存在于各种生物中，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等多种生理病理过程。GSK-3β是Wnt/β-catenin通路的负向调节剂，与轴蛋白(Axin)和结肠腺瘤样息肉病(adenomatous polyposiscoli，APC)基因形成复合物，调节β-catenin的稳定性。当GSK-3β活化后，可以磷酸化APC和β-catenin，使β-catenin降解，促进中胚层分化形成心脏[20]。本研究结果显示：用5-aza和Tan ⅡA干预后细胞中GSK-3β表达水平均有不同程度升高，而β-catenin表达水平有不同程度降低，提示5-aza和Tan ⅡA均可抑制Wnt/β-catenin信号通路，但以TanⅡA诱导组效果更明显。
综上所述，TanⅡA能诱导hPDMSCs分化为心肌细胞，且效果优于5-aza，其机制可能与TanⅡA能抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
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