中国食管癌发病率呈逐年上升趋势，居世界第1位。5年生存率仅为10%~20%。有临床证据^[1-2]表明：如果初次诊断的食管癌临床分期较早，5年生存率可升至80%~90%，但由于食管癌早期临床表现缺乏特异性，患者首次就诊时通常处于中晚期。因此，探索食管癌的发病机制，建立早期诊断的指标和方法，对降低死亡率是非常必要的。哺乳动物线粒体核糖体蛋白(mitochondrial ribosomal protein，MRP)由一个大39s亚基和一个小28s亚基组成。MRPL35基因编码一个39s亚基的亚单位蛋白，序列分析^[3-5]显示：MRPL35存在3种同源体，在染色体6p、10q和Xp上发现了对应此基因的假基因。KOC等^[6]发现：MRPL35蛋白的序列与菠菜叶绿体L35(P23326)具有高度的同源性(27.3%)。MRPL35与大肠杆菌L35有26.6%的序列是相同的。BOX等^[7]提出MRPL35参与协调蛋白质的合成和氧化磷酸化，从而调节线粒体的生物能量容量。MENEZES等^[8]发现：MRPS7(参与编码线粒体核糖体蛋白小28s亚基)突变后，线粒体复合呼吸链(RC)功能障碍，引发先天性感音神经性耳聋和进行性肝肾功能衰竭。目前关于MRPL35的研究多局限于结构分析，尚未见其与肿瘤相关的功能研究。MRP家族可以通过影响线粒体RC来影响细胞功能，因此推测沉默MRPL35基因可影响食管癌细胞功能。本研究旨在探讨MRPL35对食管癌TE-1细胞增殖的作用，以期为食管癌的早期筛查及肿瘤新型靶向治疗提供依据。

食管癌ECA109和KYSE150细胞株均储存于吉林大学第二医院中心实验室，食管癌TE-1细胞购于上海吉凯公司并经过STR认证。根据RNA干扰序列设计原则，以MRPL35基因为模板，设计多个19-21ntRNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取GTCAAGAATGCCTCTCTTA序列作为干扰靶点，慢病毒载体购于上海吉凯公司。RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)和青-链霉素双抗购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒、M-MLV反转录试剂盒、qPCR试剂盒和总蛋白质提取试剂盒购自北京全式金公司，Western blotting抗体购自美国AFFINITY公司，细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-PE/7AAD购自美国BD公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。37℃恒温培养箱和酶标仪(美国Thermo公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)。

胰酶消化收集5×10⁵ mL^-1细胞，离心去上清液，将1mL Trizol加入到细胞沉淀中。依次加入氯仿-异丙醇-乙醇，离心、洗涤得到RNA沉淀，静止干燥至沉淀基本透明时，加入RNase-free水至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析确定提取RNA浓度和纯度。使用M-MLV逆转录试剂盒通过反转录提取cDNA。以GAPDH为内参照，设3个复孔，采用两步RT-PCR法检测细胞中MRPL35 mRNA表达水平，采用2^-ΔΔCT法计算MRPL35 mRNA表达水平。

取对数生长期食管癌TE-1细胞，以每孔1×10⁵个细胞接种于6孔板中, 分为shMRPL35组和shCtrl组，按实验设计向shMRPL35组加入沉默靶基因带有嘌呤霉素抗性的si-RNA慢病毒，向shCtrl组加入等量的带有嘌呤霉素抗性阴性对照si-RNA慢病毒，转染12h后换含10%胎牛血清、1%双抗的1640普通培养液，继续培养。72h后于荧光显微镜下观察细胞感染效率和细胞状态。提取RNA并以与上述相同的方式逆转录为cDNA。采用Western blotting法检测MRPL35蛋白表达水平[包括提取蛋白、蛋白浓度测定、SDS-PAGE凝胶配置、上样电泳、免疫印迹(湿转)、封闭、抗体孵育和X片显影等步骤]。利用Imagine J分析软件，以GAPDH内参蛋白条带灰度为1，目的条带灰度值越大，表示蛋白表达水平越高。观察细胞状态良好、si-RNA可有效敲减MRPL35即重复上述步骤，转染病毒，更换含10%胎牛血清和1%双抗的1640普通培养液培养24h后，加入由上述培养液配制的浓度为1.8 mg·L^-1的嘌呤霉素溶液，连续培养7d，每天更换含1.8 mg·L^-1嘌呤霉素的培养液，7d后荧光显微镜下通过病毒转染后的绿色荧光蛋白观察感染效率，细胞全部发出绿色荧光代表细胞全部转染慢病毒，即稳定系构建成功，继续培养待行后续实验。

按以上实验分组，胰酶消化，将慢病毒感染后的细胞，以2×10⁴ mL^-1的细胞密度接种于96孔板, 每孔接种100μL细胞悬液，设3个复孔，共铺6张板, 孵箱培养，细胞贴壁当天开始检测，培养终止前2h换液加入10μL CCK-8溶液于孔中。2h后完全振荡器振荡2~5 min，连续6d采用酶标仪在450nm处检测吸光度(A)值，取各组平均值，表示各组细胞生长速度。

按以上实验分组，胰酶消化，将细胞悬浮于完全培养液中，以2×10⁵ mL^-1细胞密度收集在2mL离心管中，每管收集1mL细胞悬液，设3个复管。离心弃上清，加1×binding buffer 100μL重悬细胞沉淀，分别加入5μL PE Annexin Ⅴ和7-AAD染色，室温避光15 min。补加1×binding buffer 400μL，1h内上机检测。得到流式细胞术检测散点图，计算细胞凋亡率。

采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中MRPL35 mRNA和蛋白表达水平、细胞生长速度及凋亡率以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

3种食管癌细胞均表达MRPL35基因，但3种细胞中MRPL35 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 1。通过病毒感染预试验，食管癌细胞TE-1细胞状态更加稳定，因而选择TE-1细胞进行下一步实验。

图 1 3种食管癌细胞中MRPL35 mRNA表达水平 Fig. 1 Expression levels of MRPL35 mRNA in three kinds of esophageal cancer cells

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TE-1细胞经慢病毒转染后，感染效率达到80%以上，细胞状态正常(图 2，见插页一)。定量PCR法检验结果显示：经shRNA慢病毒感染后，与shCtrl组比较，shMRPL35组TE-1细胞中MRPL35 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)，敲减效率达到85.6%。Western blotting法检测结果显示：shMRPL35组TE-1细胞MRPL35蛋白表达水平较shCtrl组明显降低(P < 0.05)。见图 3和表 1。经检验沉默MRPL35靶点有效，加嘌呤霉素浓度为1.8 mg·L^-1培养液连续7d筛选稳定系，慢病毒几乎转染全部细胞。

A: Cells transfected by virus; B: Cells expressing green fluorescent protein. 图 2 病毒转染后的转染效率和细胞状态(×20) Fig. 2 Transfection efficiency and cell status after virus transfection(×20)

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Lane 1:ShCtrl group; Lane 2:ShMRPL35 group. 图 3 2组TE-1细胞中MRPL35蛋白表达电泳图 Fig. 3 Electrophoregram of expressions of MRPL35 protein in TE-1 cells in two groups

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细胞贴壁后生长2 h~1 d，2组细胞生长速度比较差异无统计学意义(P > 0.05)；细胞贴壁生长2d，shMRPL35组细胞生长速度(0.172±0.005)明显低于shCtrl组(0.198±0.007)，差异有统计学意义(P < 0.05)。随着时间的增加, 与shCtrl组比较，shMRPL35组细胞生长速度明显减缓(P < 0.05)。见图 4。

图 4 2组TE-1细胞的生长速度 Fig. 4 Growth speeds of TE-1 cells in two groups

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Annexin Ⅴ-PE/7AAD双染流式细胞术检测散点图可见：细胞分布于左上(UL)、左下(LL)、右上(UR)和右下(LR)4个象限，其中PE阳性(UR和LR)为凋亡细胞，7AAD单阳性细胞(UL)为坏死细胞。与shCtrl组细胞凋亡率(4.17%±0.25%)比较，shMRPL35组细胞凋亡率(13.72%±0.67%)明显升高(P < 0.01)。见图 5。

A:ShCtrl group; B:ShMRPL35 group. 图 5 流式细胞术检测2组TE-1细胞凋亡率 Fig. 5 Apoptotic rates of TE-1 cells in two groups detected by flow cytometry

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目前，每年有近400000例食管癌患者死亡，尽管采用现代外科技术结合放疗和化疗等食管癌治疗方法，患者预后仍然较差^[9-10]。计算机断层扫描(CT)不能准确地识别局灶性食管癌，钡餐造影可鉴别不规则狭窄或肿块，上消化道内镜活检和组织学检查是食管癌诊断的金标准^[11]。食管癌目前并没有特异性好的血清学标志物，临床常联合影像学和鳞癌、腺癌相关血清学标志物来进行辅助诊断, 其中具有代表性的血清学标志物为C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，其高表达CRP的食管癌患者生存期较短。NAKATSU等^[12]对肿瘤组织免疫组织化学分析结果表明：59%的食管癌组织可检出CRP阳性表达。因此探索食管癌相关生物标记物进行流行病学的早期筛查，对提高我国食管癌患者的存活率，降低死亡率尤为重要。

MRP家族中研究较多的为MRPL12，有研究^[13]表明：HeLa细胞中过表达的MRPL12参与活化核糖体的转录和翻译。NOUWS等^[14]发现：MRPL12可与MRPL10相互作用调节细胞周期和增殖。另一项关于人皮肤成纤维细胞的研究^[15]显示：MRPL12的突变会导致细胞的增殖阻滞。以上研究均表明：MRPL12与细胞的增殖和凋亡有关，MRP家族可能通过参与核糖体的蛋白转录翻译功能，调控细胞增殖，但其机制尚不清楚。细胞的生理学可以看作是蛋白质共同作用形成的产物，通过蛋白质-蛋白质相互作用网络组装成复合物、细胞器和信号转导途径^[16]。MRPL35作为MRP大39s亚基编码基因可能通过以上生理活动参与调控肿瘤细胞的增殖。本研究采用慢病毒为载体的RNA干扰(RNAi)技术，病毒基因组整合于宿主基因组, 长时间、稳定沉默目的基因^[17]，且转染后细胞状态未见明显异常。本研究结果显示：shMRPL35组TE-1细胞中MRPL35 mRNA和蛋白表达水平较shCtrl组明显下调(P < 0.05)，说明载体沉默基因靶点无误且高效抑制基因表达；与shCtrl组比较，shMRPL35组MRPL35基因沉默后食管癌细胞TE-1增殖能力明显受到抑制；利用Annexin Ⅴ-PE/7ADD双染流式细胞术检测，shMRPL35组细胞凋亡率较shCtrl组明显升高(P < 0.01)。本研究结果表明：MRPL35基因在食管癌TE-1细胞的增殖和凋亡中起着关键作用。MRPL35表达下调后，食管癌细胞TE-1增殖能力受到了抑制，且与凋亡有关。细胞凋亡途径主要有细胞膜途径、线粒体途径和内质网途径3种。基因沉默后，经过某一种途径使得凋亡调控分子进行相互作用，则可选取经典的细胞增殖和凋亡通路，验证MRPL35与下游调控通路的关键基因蛋白的相互作用，进一步探究MRPL35的调控机制。有研究^[18-21]报道：线粒体核糖体蛋白MRPS18-2(S18-2，NP014765)与视网膜母细胞瘤蛋白(RB，NPY000 0312)结合，并阻止转录因子E2F1(NPY05216) -RB复合物的形成，导致细胞核中游离E2F1蛋白水平升高，随后促进进入S期，MRPS18-2的过度表达导致原代大鼠胚胎成纤维细胞永生化，推测MRPS18-2是一种新发现的癌基因，可能参与癌变过程。MRPL35基因与MRPS18-2基因同样编码线粒体核糖体蛋白大小亚基，MRPL35基因是否也同为癌基因，其与食管癌发生的关系，以及在细胞增殖、氧化磷酸化、细胞呼吸和其他氧化还原反应中涉及的基因是否存在上调，其代谢是否更加活跃，有待于进一步研究。

本研究结果表明：MRPL35基因与食管癌TE-1细胞增殖有关联。通过慢病毒介导的RNAi技术沉默MRPL35基因，能够抑制食管癌TE-1细胞的增殖能力。本研究结果可为食管癌的发生发展机制的研究提供理论基础，并可能为食管癌的早期诊断提供确切的依据。