2019, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 袁中政, 刘引, 申玉芹, 林崇韬
- YUAN Zhongzheng, LIU Yin, SHEN Yuqin, LIN Chongtao
- 牙周炎患者自身组织核酸对小鼠巨噬细胞中NLRP3 mRNA表达的影响及其意义
- Effect of periodontitis patient's own tissue nucleic acid on expression of NLRP3 mRNA in murine macrophages and its significance
- 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(01): 23-27
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2019, 45(01): 23-27
- 10.13481/j.1671-587x.20190105
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-20
2. 江苏省无锡口腔医院牙周科, 江苏 无锡 214000;
3. 吉林大学口腔医院牙周科, 吉林 长春 130021
2. Department of Periodontology, Wuxi Stomatology Hospital, Jiangsu Province, Wuxi 214000, China;
3. Department of Periodontology, Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
牙周炎是一种由局部免疫失衡导致的牙周组织慢性感染性疾病，其进展及严重程度与宿主自身免疫性炎症反应存在密切关联[1]。炎性小体是位于细胞质中的多蛋白复合物[2]。研究[3-4]证实：炎性小体NLRP3作为固有免疫应答的重要组成部分，参与牙周炎症的发生和发展。NLRP3炎性因子活化可由病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)激活或体内自身产生的损伤相关分子模式(danger- associated molecular patterns, DAMPs)激活[5-6]。
在牙周组织免疫性炎症反应过程中，牙周自身组织核酸参与牙周疾病的发展，并可能调控牙周炎发病机制。牙周自身组织来源的核酸属于宿主衍生DAMPs，为内源性危险信号[7]。本课题组前期研究[8]显示：牙周炎患者自身组织核酸作为机体免疫反应的DAMPs，与牙周组织的损伤过程和炎性相关因子NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)关系密切。
目前，有关牙周炎患者自身组织核酸作为一类DAMPs是否通过激活NLRP3炎性小体对牙周炎症产生作用尚未见报道。本研究拟通过提取牙周炎患者局部组织核酸，将其作为牙周组织内DAMPs，通过检测牙周自身组织核酸刺激小鼠巨噬细胞后NLRP3炎性小体等炎性相关因子表达的变化，探讨牙周自身组织核酸在牙周局部固有免疫应答反应中所起的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞培养选择小鼠巨噬细胞RAW264.7(ATCC号：TIB-71)为实验细胞，复苏，接种于含10%胎牛血清(美国HyClone公司)的低糖DMEM培养基(美国Gibco公司)中，5%CO2、37℃条件下培养，隔日换液，待细胞长满平皿80%~90%时，用细胞刮轻柔地将贴壁的细胞刮下，吹打离心，传代培养，备用。荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态及形态表现。
1.2 临床资料选取吉林大学口腔医院牙周科就诊的患者收集牙周组织。所有患者要求身体健康，无系统性疾病(糖尿病、肝功能或肾功能障碍、自身免疫性疾病和传染性口炎)；3个月内无抗生素服用史；妇女无妊娠。所有患者研究知情，并签署知情同意书。健康组纳入标准：口腔卫生状况良好；口内天然牙大于20颗，且至少有4颗磨牙；余牙探诊深度(probing depth, PD)均小于3 mm，临床附着丧失(clinical attachment loss, CAL)均小于1 mm，无明显牙龈红肿或退缩，所有位点探诊出血为阴性；口腔内无黏膜病损[9]。慢性牙周炎组纳入标准：依据ARMITAGE新分类法[10]选取符合慢性牙周炎诊断标准的患者；口腔内天然牙大于16颗，且至少有4颗磨牙，磨牙中至少有1个位点PD ≥ 4 mm；口腔内无黏膜病损。健康组：依据以上标准选取牙周组织健康需行冠延长术的患者26例，年龄16~34岁，平均年龄(24.6±5.4)岁，菌斑指数(plaque index，PLI)为0.5±0.6，改良出血指数(modified bleeding index，mBI)为0.3±0.4，PD为(1.82±0.53)mm。慢性牙周炎组：依据以上标准选取慢性牙周炎患者26例，年龄36~65岁，平均年龄(45.6±6.2)岁，PLI为2.52±1.77，mBI为3.30±1.75，PD为(6.56±0.54)mm，CAL为(4.75±1.73)mm。
1.3 牙周组织样本收集牙周组织样本，包括上皮和结缔组织。健康组牙周组织取自牙周组织健康需行冠延长术者；慢性牙周炎组取自经牙周基础治疗后6周行翻瓣术的慢性牙周炎患者，术中取牙周组织，术区要求：PD > 5mm，CAL > 3mm，探诊后出血(BOP) (+)，X线示患牙骨吸收不超过根中1/2。获得组织样品后立即放入无菌试管中，－20℃冻存备用。
1.4 实验分组使用Hipure Total RNA Kits组织RNA快速提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取牙龈组织中总RNA。采用NanoDrop®ND-1000型分光光度计测定总RNA浓度(单位：μg·L-1)。按照逆转录试剂盒说明书逆转录总RNA为cDNA，－20℃冻存备用。RAW264.7细胞接种于6孔板，每孔5×105个细胞。待细胞完全贴壁后，换无血清低糖DMEM饥饿24 h。细胞分为对照组和实验组，分别加入已提取的健康牙周组织cDNA和炎症牙周组织cDNA，cDNA质量浓度为1 mg·L-1，分别孵育4、6和8 h后检测。
1.5 实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测RAW264.7细胞中炎症相关因子mRNA表达水平采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1(cysteinylaspartale specific protease-1，caspase-1)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)mRNA表达水平。RT-PCR引物的基因序列见表 1。RT-PCR反应体系：上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Dye Ⅱ 0.5 μL，cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，蒸馏水补总体积至25 μL, 测定Ct值(M×3005P型RT-PCR仪)，确认反应的扩增曲线和溶解曲线，生成曲线应为完全单一峰。以HPRT1为内参基因，通过相对定量2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因表达的倍数，即目的基因mRNA表达水平。
| Gene | Primer Sequence | Size (bp) |
| HPRT1 | F:5′-TGACACTGCCAAAACAATGCA-3′ R:5′-GCTTGCGACCTTGACCATCT-3′ |
2120 |
| NLRP3 | F:5′-CTGTAACATTCGGAGATTGTGGTT-3′ R:5'- GACCAAGGAGATGTCGAAGCA-3′ |
2421 |
| Caspase-1 | F:5′-CCGCAAGGTTCGATTTTCA-3′ R:5′-ACTCTTTCAGTGGTGGGCATCT-3′ |
1922 |
| IL-1β | F:5′-CCTTGGGCCTCAAGGAAAA-3′ R:5′-TCTCCAGCTGTAGAGTGGGCTTA-3′ |
1923 |
| IL-18 | F:5′-ACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACT-3′ R:5′-CCAGGTTTTCATCATCTTCAGCTA-3′ |
2624 |
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平以x±s表示，在符合正态分布的前提下，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RAW264.7细胞生长和形态表现显微镜下观察：细胞生长状态良好，形态似圆形和多边形，有伪足，一般以单核为主，部分细胞2~3个细胞核，胞浆透明，胞体丰满(图 1，见插页一)。
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| A:×10; B:×40; C:×100 图 1 小鼠巨噬细胞RAW264.7的形态表现 Fig. 1 Morphology of murine macrophages RAW264.7 |
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RAW264.7细胞孵育4 h时，与对照组比较，实验组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见表 2。
| (n=3, x±s) | ||||
| Group | NLRP3 mRNA | Caspase-1mRNA | IL-1βmRNA | IL-18mRNA |
| Control | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 |
| Experiment | ||||
| 4 h | 8.312±0.852**△ | 2.636±0.433**△ | 9.683±0.643*△ | 10.073±0.562**△ |
| 6 h | 12.440±0.755** | 3.828±1.862** | 11.630±1.460* | 11.690±1.326** |
| 8 h | 9.460±0.537**△ | 3.625±0.746**△ | 10.656±0.478*△ | 10.289±0.465**△ |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; △P < 0.01 vs 6 h group. | ||||
RAW264.7细胞孵育6 h时，实验组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平进一步升高(P < 0.05或P < 0.01)；与4 h时比较，实验组RAW264.7细胞中各炎症因子mRNA表达水平均明显升高(P < 0.01)。见表 2。
RAW264.7细胞孵育8 h时，与对照组比较，实验组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；随着培养时间的延长，与6 h时比较，实验组RAW264.7细胞中各炎症因子表达水平均有所降低(P < 0.01)，但与4 h时比较差异无统计学意义(P>0.05)。6 h时实验组RAW264.7细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平高于4和8h。见表 2。
3 讨论炎性小体活化是多蛋白复合物组装介导炎症相关因子的成熟过程[11-13]。研究[14-16]表明：NLRP3炎性小体调控caspase-1的活化，首先形成NLRP3/pro-caspase-1蛋白复合物，pro-caspase-1自剪切成活化形式，活化的caspase-1依次将促炎因子IL-1β和IL-18加工成熟并分泌到细胞外。IL-1β和IL-18是2种关键的促炎因子，在机体炎症反应初始应答中发挥关键作用，严格调控NLRP3的活化，对IL-1β和IL-18的成熟及分泌有重要意义，故本研究选取NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18作为检测牙周炎患者自身组织核酸对小鼠巨噬细胞中炎性相关因子表达水平的目的基因进行研究。
研究[17-18]表明：牙周炎患者自身组织核酸作为DAMPs对牙周炎的发生起关键作用。自身组织来源的核酸类DAMPs与牙周致病菌等外源性核酸类PAMPs相似，均可激活牙周组织炎性相关信号通路，启动牙周组织固有免疫应答[19-20]。在本实验中，首先于临床患者中收集健康牙周组织和炎症牙周组织，分别提取组织总RNA，逆转录成cDNA作为牙周炎患者自身组织核酸，刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，结果显示：与对照组比较，炎症牙周组织核酸刺激小鼠巨噬细胞4、6和8h后炎性相关因子NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均升高，尤其在6h时炎性相关因子NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平升高最为明显，证实在局部牙周组织内，牙周炎患者自身组织核酸作为一种DAMPs，激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎性小体复合物，影响牙周局部固有免疫应答反应，从而参与牙周组织局部炎性反应，且在6h时促进作用最为明显。另外，caspase-1 mRNA表达水平较NLRP3、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平低的原因可能是与caspase-1活化后部分裂解有关，与吴冷等[21]研究结果一致。本课题组前期研究[8]显示：牙周炎患者自身组织核酸中，炎性相关因子表达水平升高。本研究进一步证实牙周炎患者自身组织核酸同时可促进RAW264.7细胞中炎性相关因子表达。
本研究采用牙周炎患者自身组织核酸作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7不同时间，观察其对细胞中不同炎性因子mRNA表达的影响，结果提示：牙周炎患者自身组织核酸作为DAMPs对RAW264.7细胞即破骨细胞的活化具有免疫调节作用，同时证实该活化作用随时间的变化而有所不同。随着对感染性牙周疾病导致的破骨细胞的活化作用机制的深入研究，寻求一种免疫抑制剂对其进行干预以阻断破骨细胞的活化，可为临床治疗牙周炎提供理论基础。
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