蚓激酶(lumbrokinase, LBK)^[1-3]在临床上用于预防和治疗血栓性疾病^[4-6]。近年来关于LBK抗肿瘤的研究较多，研究^[7-8]结果显示：LBK对多种肿瘤均有一定的治疗作用。余玲俐等^[9]和WAGNER^[10]研究发现：LBK对肺癌细胞A549有抑制增殖和促凋亡作用。余艳秋等^[11]研究发现：蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞株MGC803有抑制增殖和诱导凋亡作用；研究^[12-15]表明：蚯蚓纤溶酶对人肝癌细胞(SMMC-7721)有抑制侵袭和转移作用，同时蚯蚓纤溶酶有抑制胃癌细胞增殖的作用，并可降低胃癌细胞和血管内皮细胞的黏附性，降低胃癌细胞黏附分子CD44v6的表达。目前LBK对胃癌细胞株SGC7901的作用尚未见报道。本研究采用LBK作用于体外培养的胃癌细胞株SGC7901，探讨其对SGC7901细胞增殖、相关凋亡蛋白表达和细胞周期等的影响，为LBK在抗胃癌方面的作用及机制提供实验依据。

LBK购于陕西百威生物科技有限公司。RPMI1640培养基、EDTA、MTT、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素(美国Gibco公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，全蛋白提取试剂盒和RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(美国Sigma公司)，β-actin、小鼠抗人Bcl-2抗体、小鼠抗人Bax抗体和小鼠抗人caspase-3抗体(美国BD公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海贝博生物试剂公司)。倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)。

于液氮中取出冻存的胃癌细胞株SGC7901，迅速置于37℃水浴中解冻，置于无菌15 mL离心管中，补加10 mL DMEM培养基后1 000 r·min^-1离心5 min。弃上清后补加含有10%胎牛血清和100 U·mL^-1青霉素、链霉素的DMEM培养基8 mL，轻轻吹打重悬细胞后转移至25 mL细胞培养瓶中，于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养，每2~3d传代1次，传代至第3代用于实验。

经预实验，初步确定LBK有效剂量为4 U·mL^-1，故本研究选用的蚓激酶低、中和高剂量分别为2、4和8 U·mL^-1。

取96孔板，将细胞密度稀释至1×10⁵ mL^-1，每孔加入200μL，培养24h后，弃去上清。对照组加入培养基，LBK药物组分别加入2、4和8 U·mL^-1各200μL，设3个复孔。培养至24、48和72h时，弃去上清，加入MTT(5 g·L^-1)20μL，继续培养4h，弃去上清，加入DMSO 150μL，轻轻震荡10 min，待颗粒完全溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度[A(490)]值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1－实验组A(490)值/对照组A(490)值] ×100%。

取对数生长期SGC7901细胞，用不含血清的培养基混悬细胞，将细胞密度稀释至5 ×10⁵ mL^-1，接种于6孔细胞培养板，每孔2.0mL。用Marker笔沿着6孔板直径平行等距划线，用于定位，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，观察细胞融合状态。用200μL微量移液器的吸管垂直于定位横线垂直方向均匀划线，划痕完毕后，用移液器缓慢吸出培养液，用不含血清的培养基洗涤细胞2次，除去细胞碎片。将细胞分为对照组、4 U·mL^-1 LBK组和8 U·mL^-1 LBK组，每组分别加入培养基、4 U·mL^-1 LBK和8 U·mL^-1 LBK各2.0mL，培养24和48h，将6孔板置于倒置显微镜下观察结果并拍照，使用Image J软件打开图片后，随机划取6条水平线，测量划痕宽度，取平均值。

取细胞悬浮液，加入6孔细胞培养板，培养24h。弃去上清，分为对照组、4 U·mL^-1LBK组和8 U·mL^-1LBK组，分别加培养基、4U·mL^-1LBK和8 U·mL^-1LBK各2.0 mL，培养24h后，弃去上清。用冷的PBS洗涤细胞2次，收集细胞，用1×Annexin Ⅴ400μL结合液悬浮细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5μL，轻轻混匀，于2℃~8℃避光条件下孵育15 min。加入10 μL PI染色液后轻轻混匀，2℃~8℃避光条件下孵育5 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

取对数生长期的SGC7901，稀释为5×10⁵ mL^-1的单细胞悬液，以每孔2mL接种于6孔细胞培养板后，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。弃掉原孔内培养液，每孔加入1.0mL不同浓度的药物溶液(4和8 U·mL^-1LBK)，同时设对照组(加培养基)，含药培养24h，将细胞置37℃、5%CO₂培养箱中孵育。用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500 r·min^-1离心5 min，离心温度控制在2℃~8℃。用冷的PBS洗涤细胞2次(2℃~8℃，1500 r·min^-1离心5 min)，收集细胞。加入10μL PI染色液后轻轻混匀，于2℃~8℃避光条件下孵育5 min后使用流式细胞仪检测。计算G₁期、S期和G₂期细胞百分率。

细胞分组同上，作用48h后，收集细胞，裂解，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶，4%浓缩胶)，转膜，室温下5%BSA封闭，加入一抗，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。用Quanlity One分析软件分析目的条带的相对灰度值(以β-actin为内参)，以Bax/β-actin表示Bax蛋白表达水平，以Bcl-2/β-actin表示Bcl-蛋白表达水平，以caspase-3/β-actin表示caspase-3蛋白表达水平。

采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、细胞划痕宽度、细胞凋亡率、不同细胞周期细胞百分率及Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

药物处理细胞24、48h和72 h后，LBK对细胞增殖均有抑制作用，且呈浓度-时间依赖性。与对照组比较，各剂量LBK组细胞增殖抑制率明显升高(P < 0.01)。见表 1。

细胞培养至48 h，与对照组[(480.0±2.4) μm]比较，4和8 U·mL^-1LBK组SGC7901细胞划痕距离[(570.0±3.3)μm和(650.0±5.4)μm]明显增加(P < 0.01)。见图 1。

A:Control group B:4 U·mL-1LBK group; C:8 U·mL-1LBK group. 图 1 各组SGC7901细胞划痕距离(Bar=100 μm) Fig. 1 Migration distances of SGC7901 cells in various groups (Bar=100 μm)

图选项

与对照组(9.85%±1.02%)比较，4和8 U·mL^-1LBK组细胞凋亡率(23.83%±1.12%和28.93%±1.43%)均明显升高(P < 0.01)。见图 2。

A: Control group; B:4 U·mL-1 LBK group; C: 8 U·mL-1LBK group. 图 2 流式细胞术检测各组SGC7901细胞凋亡率 Fig. 2 Apoptotic rates of SGC7901 cells in various groups detected by flow cytometry

图选项

与对照组比较，4和8U·mL^-1LBK组SGC7901细胞中G₁期细胞百分率明显降低(P < 0.01)，S期和G₂期细胞百分率明显升高(P < 0.01)。见表 2和图 3。

A: Control group; B:4 U·mL-1 LBK group; C: 8 U·mL-1LBK group. 图 3 流式细胞术检测各组SGC7901细胞的细胞周期 Fig. 3 Cell cycle of SGC7901 cells in various groups detected by flow cytometry

图选项

作用48 h后，与对照组比较，4和8 U·mL^－1LBK组细胞中Bcl-2表达水平明显降低(P < 0.05)，Bax和caspase-3蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。见图 4和表 3。

Lane 1:Control group; Lane 2:4 U·mL-1 LBK group; Lane 3: 8 U·mL-1 LBK group. 图 4 各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达电泳图 Fig. 4 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax, and caspase-3 proteins in SGC7901 cells in various groups

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蚯蚓提取物具有多种生物学活性。LBK是从鲜蚯蚓体内提取的活性成分，鲜蚯蚓经过炮制后成为中药材地龙。中药的抗肿瘤活性已有报道，中医理论认为LBK主要具有清热解毒、活血化瘀及扶正固本等作用，目前在临床上作为溶栓药物具有良好的活血化瘀功效。本研究旨在揭示LBK对胃癌细胞的增殖抑制作用。JIANG等^[16]研究了LBK对急性中危肺血栓栓塞的治疗效果和安全性；LBK结合低分子肝素是治疗急性和中度风险肺血栓栓塞的安全有效的策略^[17]。研究^[18-19]结果表明：在大鼠颈动脉血栓形成模型中，经腰椎部位给予LBK治疗可改善药代动力学特征，提高抗血栓作用。李洪燕等^[20]以人胃腺癌细胞BGC823、乳腺癌细胞MCF7、结肠癌细胞HCT-8、肝癌细胞Bel7402和肺腺癌细胞A549为模型，进行了蚯蚓纤溶酶的抗肿瘤活性研究。

本研究采用MTT法检测LBK对胃癌细胞株SGC7901的增殖抑制作用，结果表明：培养至24h，LBK剂量为2U·mL^-1时，对细胞增殖抑制率为14.25%，随着给药剂量增加及培养时间延长，LBK对胃癌细胞株SGC7901增殖抑制作用逐渐增强，培养至72h，当浓度为8U·mL^-1时，对细胞增殖抑制率高达62.59%。细胞划痕实验是一种操作简单、经济实惠的研究细胞侵袭的体外试验方法，本研究结果表明：与对照组比较，培养至48h时，剂量为8U·mL^-1的LBK能够明显抑制SGC7901细胞的迁移，说明LBK对SGC7901细胞有较强的抑制作用；免疫印迹实验结果显示LBK能明显下调细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax和caspase-3蛋白表达；流式细胞术观察到LBK作用于SGC7901细胞后，细胞早晚期凋亡率均升高，且呈剂量依赖性，与MTT结果一致；细胞周期检测结果表明：LBK作用于SGC7901细胞24h后，能抑制细胞进入G₁期，延长G₂期，阻止细胞增殖。

综上所述，LBK对胃癌细胞株SGC7901具有明显的增殖抑制作用，能够诱导细胞凋亡。本研究结果为LBK用于胃癌的治疗研究提供了初步的实验依据，为下一步体内动物实验以及更深入的机制研究奠定了基础。