扩展功能
文章信息
- 王颖芳, 王鹏飞, 段广才, 郗园林, 张晓萌, 詹煜慧
- WANG Yingfang, WANG Pengfei, DUAN Guangcai, XI Yuanlin, ZHANG Xiaomeng, ZHAN Yuhui
- 志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的特点及其关联性分析
- Characteristics of clustered regularly interspaced short palindromic repeats in Shigella and their correlation analysis
- 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(06): 1131-1137
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(06): 1131-1137
- 10.13481/j.1671-587x.20180604
-
文章历史
- 收稿日期: 2018-02-09
2. 郑州大学公共卫生学院流行病学教研室, 河南 郑州 450001;
3. 河南科技大学医院, 河南 洛阳 471023;
4. 河南科技大学医学院, 河南 洛阳 471023
2. Department of Epidemiology, School of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China;
3. Hospitalof Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;
4. College of Medical Sciences, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China
成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年发现的一种对外源核酸片段具有获得性免疫能力的结构,主要由一段不连续的正向重复序列和插入其中的间隔序列组成[1]。重复序列和间隔序列构成的单元经常被整体删除,使得CRISPR系统迅速进化,一定程度上也反映了细菌在进化中的保守性和包容性。志贺菌引起的细菌性痢疾(简称菌痢)是一个全球性的公共卫生问题,尤其给发展中国家造成重大危害,其引起的感染性腹泻给我国带来了巨大的经济和社会负担[2-3]。随着抗生素的广泛应用,志贺菌耐药形势越来越严重,且多耐药菌株也越来越多,而外源性耐药基因的获得,即耐药基因的水平转移,是细菌增强耐药性的主要方式之一[4-5]。
CRISPR及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins, CAS)组成的CRISPR/Cas系统能够形成特异免疫机制来处理外来遗传物质入侵,这可能与致病菌耐药性的变迁有密切关系[6]。每个CRISPR元件的重复序列对应着一种潜在的CRISPR/Cas靶标,CRISPR/Cas系统获得新的间隔序列后能够在未来识别相应的病原体而发挥作用,故间隔序列是CRISPR/Cas系统最终发挥功能作用的核心序列元件[7-8]。在志贺菌中一般包括3个CRISPR位点,即CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3,其中CRISPR1和CRISPR2具有相同的重复序列,两者距离比较近,关于志贺菌中CRISPR结构与其耐药性和毒力研究[9-11]也逐渐增多。目前,国内外对细菌CRISPR的研究逐渐增多,CRISPR/Cas9是应用较为广泛的一个系统,但是对CRISPR的基础研究尚处于探索阶段,CRISPR可能通过某一个位点来发挥功能,也可能存在一种共协调机制[7, 12-13]。本研究针对数据库中的志贺菌CRISPR进行分析,对实验室保存的志贺菌株CRISPR序列进行检测,研究志贺菌中CRISPR-Q1的特点,同时阐述CRISPR各位点之间的联系,为进一步揭示CRISPR的结构特征及其作用机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 菌种、主要试剂和仪器本研究采用GenBank中志贺菌基因组(共有107株, 包含全基因组和鸟枪法全基因组)。本研究还选用了12株由实验室保存的志贺菌菌株,均为河南省分子医学重点实验室收集保存。志贺菌的基本信息见表 1。
Number | Strain | Type | Note |
4 | mel-sf2003101/sx | SF | Suixian in Henan province |
7 | mel-sf2004004/sx | SF | Suixian in Henan province |
8 | mel-sf2004026/sx | SF | Suixian in Henan province |
12 | mel-sf2005082/sx | SF | Suixian in Henan province |
16 | mel-sf2006099/hn | SF | CDC in Henan province |
25 | mel-sf2007123/hn | SF | CDC in Henan province |
40 | mel-sf2008131/hn | SF | CDC in Henan province |
48 | mel-sf1996016/jx | SF | Tonggu in Jiangxi province |
69 | mel-ss1998011/zz | SS | Zhengzhou in Henan province |
71 | mel-sf1998024/zz | SF | Zhengzhou in Henan province |
74 | mel-sf20131656/bj | SF | 302 hospital in Beijing city |
76 | mel-sf20131736/bj | SF | 302 hospital in Beijing city |
SS: Shigella sonnei; SF: Shigella flexneri. |
细菌基因组提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)、酵母浸粉和胰蛋白胨(英国Oxoid公司),琼脂粉(美国Sigma公司),水解酪蛋白(mueller-Hinten,MH)和琼脂(上海化学试剂有限公司),pH精密试纸(天津市金达化学试剂厂),其他常规试剂均为国产分析纯,液体培养基在本实验室按配方配制。LabcyCler basic梯度PCR仪和BP221S电子天平(德国SensoQuest公司),DYY-Ⅲ2型稳压稳流定时电泳仪和DYC31B型水平电泳槽(北京六一仪器厂),Gene Genius Bioimaging System(美国Syngene公司),THZ-92C台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂),HVE-50型自动电热压力蒸汽灭菌器(日本Hirayama公司)。本研究采用的本地软件和网络服务器包括:DNAMAN、ClustalX、Bioedit、CRISPR database(http://crispr.upsud.fr/crispr/)和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
1.2 CRISPR识别根据本实验室前期工作[14-17]获得CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1共3个CRISPR的侧翼序列信息。下载GenBank数据库中的107株志贺菌序列后,采用Bioedit软件创建本地志贺菌数据库;使用BLAST和已有的侧翼序列信息,下载每种志贺菌每个CRISPR位点的序列,然后利用多序列比对等方法获得每个菌株CRISPR的重复序列、间隔序列及相应的序列信息。
利用CRISPR的引物对12株临床分离志贺菌CRISPR进行扩增。引物序列信息为:CRISPR1的上游引物序列是5′-AGCGACTAACTGGAATCTTG-3′,下游引物序列是5′-CAATCTGGCTACTGGAAGTG-3′,退火温度为56℃;CRISPR2的上游引物序列是5′-CGATCCAGAGCTGGTCGAATG-3′,下游引物序列是5′-AGTGCTCTTTAACATAATGGATG-3′,退火温度为56℃;CRISPR-Q1的上游引物序列是5′-ACCGCTGGCATCGTTGTTG-3′,下游引物序列是5′-ATGAGCGTGGACGAAGTGC-3′,退火温度为55℃。
1.3 PCR反应条件和扩增条件CRISPRs序列扩增体系(50 μL):10×buffer(含Mg2+)5 μL,dNTPs 8 μL,上下游引物各2 μL,模板DNA 4 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O 28.5 μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性60 s, 55℃或56℃退火60 s,72℃延伸1 min,共进行32个循环,最后72℃延伸10 min。
1.4 CRISPR的检测和分析委托上海生物工程股份有限公司对扩增产物核酸序列进行纯化和测序,获得测序结果后,采用多序列比对等方法获得12株志贺菌CRISPR的相关序列信息。结合数据库中志贺菌的CRISPR信息,对CRISPR在志贺菌中的分布、CRISPR特点和CRISPR间的相关性进行分析。采用BLAST分析CRISPR-Q1的重复序列和间隔序列在菌株中的分布以及同源性。
1.5 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。数据库中志贺菌的CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1中间隔序列数间关系分析采用χ2检验,实验室中志贺菌的CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1中间隔序列数间关系分析采用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CRISPR-Q1、CRISPR1和CRISPR2的识别及分布 2.1.1 数据库中志贺菌的CRISPR-Q1、CRISPR1和CRISPR2的识别及分布通过CRISPR的侧翼序列,获得志贺菌的CRISPR分布。有8个菌株的CRISPR1或CRISPR2含有多个间隔序列,不同菌株中所含的间隔序列数并不一致。CRISPR-Q1在志贺菌中分布广泛,一些菌株中含有多个间隔序列。见表 2。
Number | CRISPR-Q1 | CRISPR1 | CRISPR2 | ||||
Yes/No | Number of spacer | Yes/No | Number of spacer | Yes/No | Number of spacer | ||
1 | No | 0 | No | 0 | No | 0 | |
1 | Yes | 1 | Yes | 1 | No | 0 | |
1 | Yes | 1 | No | 0 | Yes | 4 | |
4 | Yes | 1 | No | 0 | Yes | 1 | |
87 | Yes | 1 | No | 0 | No | 0 | |
1 | Yes | 3 | Yes | 5 | Yes | 1 | |
3 | Yes | 3 | Yes | 1 | No | 0 | |
1 | Yes | 4 | Yes | 6 | No | 0 | |
1 | Yes | 4 | Yes | 5 | No | 0 | |
1 | Yes | 4 | No | 0 | Yes | 4 | |
3 | Yes | 4 | Yes | 1 | No | 0 | |
3 | Yes | 4 | Yes | 3 | No | 0 |
实验室的12株志贺菌中,有6株并不含有CRISPR1和CRISPR2,12株菌株均含有CRISPR-Q1。有的志贺菌中,如71号菌株,其在CRISPR1含有9个间隔序列,在CRISPR2中含有6个间隔序列,CRISPR-Q1中含有4个间隔序列。有的菌株中,如4、7和8号菌株,含有的间隔序列数则比较少。见表 3。
Number | CRISPR-Q1 | CRISPR1 | CRISPR2 | ||||
Yes/No | Number of spacer | Yes/No | Number of spacer | Yes/No | Number of spacer | ||
4/7/8 | Yes | 4 | Yes | 2 | Yes | 1 | |
71 | Yes | 4 | Yes | 9 | Yes | 6 | |
69 | Yes | 5 | Yes | 3 | Yes | 5 | |
12 | Yes | 1 | No | 0 | Yes | 6 | |
16/40/48/ 25/74/76 |
Yes | 1 | No | 0 | No | 0 |
CRISPR-Q1的重复序列具有很高的序列一致性,可利用BLAST来探索重复序列在一个菌株的染色体上的分布情况。以sf2457T(ref|NC_004741.1)为例,对重复序列(41 bp,AATGCCTGATGCGACGCTTAACGCGTCTTATCATGCCTACA)进行BLAST后显示:在染色体基因组的多个地方均存在此重复序列,尽管在某些地方的重复序列有个别碱基并不相同。CRISPR-Q1在多个菌株中存在多个间隔序列,但是这些间隔序列具有较高的序列相似性,故选择一个间隔序列来进行分析。对间隔序列(60 bp,GGTTTGTGCCGAACCGTAGGCCGGATAAGG-CGTTCACGCCGCATCCGGCAGTTGGCGCAC)进行BLAST后显示中段长度约为35 bp的序列在细菌染色体上广泛分布。见表 4。
Repeat | Spacer | |||||||
Location | Score | Consistency | Location in sf2457T Genome | Location | Score | Consistency | Location in sf2457T Genome | |
1-41 | 81.8 | 41/41 | 4573313-4573353 | 1-60 | 111.0 | 60/60 | 4573354-4573413 | |
1-40 | 71.9 | 39/40 | 1158109-1158070 | 12-59 | 73.1 | 46/49 | 298153-298201 | |
3-41 | 69.9 | 38/39 | 2641015-2640977 | 16-52 | 69.4 | 37/37 | 1924586-1924622 | |
4-41 | 67.9 | 37/38 | 2853565-2853602 | 15-50 | 67.6 | 36/36 | 444803-444838 | |
1-41 | 65.9 | 39/41 | 982443-982483 | 7-50 | 67.6 | 43/46 | 3630144-3630189 | |
1-41 | 65.9 | 39/41 | 4573414-4573454 | 16-54 | 65.8 | 38/39 | 5635-5672 | |
1-41 | 65.9 | 39/41 | 4586497-4586537 | 5-50 | 65.8 | 45/49 | 339869-339917 | |
4-40 | 65.9 | 36/37 | 4429706-4429670 | 16-50 | 65.8 | 35/35 | 594666-594700 | |
2-41 | 63.9 | 38/40 | 469744-469783 | 16-50 | 65.8 | 35/35 | 640018-640052 | |
2-41 | 63.9 | 38/40 | 2431450-2431411 | 16-50 | 65.8 | 35/35 | 648495-648529 |
对仅含1个间隔序列的12号菌株的测序序列进行BLAST,结果显示其与sf2457T具有很高的序列相似性(99%),CRISPR-Q1位于yjjV与yjjW基因之间。在sf2457T的这2个基因之间,是重复性外显回文(repetitive extragenic palindromic elements, REP)元素,此段序列中共有4个REP序列。
2.3 CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1中间隔序列数的关系 2.3.1 数据库中志贺菌的CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1中间隔序列数的关系CRISPR1和CRISPR2具有相同或是相似的重复序列,在不同菌株中的分布并不相同,CRISPR-Q1在某些菌株中具有较多的间隔序列。当一个菌株中CRISPR-Q1的间隔序列数目超过2,则该菌株中CRISPR1或是CRISPR2总是具有完整的CRISPR结构(χ2=61.6,P<0.01),其通常也含有多个间隔序列。见表 5。
Number of CRISPR-Q1 spacer |
CRISPR1/CRISPR2 | χ2 | P | |
Yes | No | |||
Number of spacer>2 | 13 | 0 | 61.6 | <0.01 |
Number of spacer≤2 | 6 | 87 |
通过研究实验室保存的志贺菌CRISPR分布发现:当一个菌株中CRISPR-Q1的间隔序列数目超过2,则该菌株中的CRISPR1或CRISPR2通常含有多个间隔序列(P=0.015)。见表 3和6。
Number of CRISPR-Q1 spacer |
CRISPR1/CRISPR2 | P | |
Yes | No | ||
Number of spacer>2 | 5 | 0 | 0.015 |
Number of spacer≤2 | 1 | 6 |
研究[14-16]显示:志贺菌CRISPR1和CRISPR2中存在的间隔序列相对较多,本研究结果同样也显示这2个位点中存在的间隔序列具有较大的差异性。CRISPR-Q1在志贺菌中分布广泛,CRISPR1和CRISPR2中的间隔序列数目也是多样的。数据库中与临床分离志贺菌的CRISPR-Q1具有相同的特点,CRISPR-Q1中的重复序列和间隔序列的部分序列在同一个菌株中分布广泛,且CRISPR-Q1序列中存在REP元素。不同的菌株中CRISPR-Q1所含的间隔序列数不同,与CRISPR1或CRISPR2有关联。
志贺菌的CRISPR类型与大肠杆菌类似,志贺菌中确定CRISPR包括CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3,其中CRISPR3具有较高的保守性,CRISPR1和CRISPR2则变化比较大[16, 18-20]。研究[16, 21]显示:CRISPR1和CRISPR2具有相同或相似的重复序列,但是间隔序列数则并不确定,CRISPR1的下游存在cas基因簇。本研究结果显示:在某些志贺菌中CRISPR1和CRISPR2位点均缺失,有些仅留下这2个CRISPR中的1个,有些则有多个间隔序列。根据CRISPR1和CRISPR2的多样性以及存在的cas基因簇,推测这2个CRISPR在某些菌株中仍具有活性。CRISPR-Q1在志贺菌中分布广泛,且在很多菌株中包含多个间隔序列。研究[15]显示:该CRISPR的重复序列在亲缘关系较远的菌株中也有发现,故其对于细菌可能具有特别的意义,其功能需要进一步研究。
不管是在同一个菌株中,还是在不同的菌株中,CRISPR-Q1中的重复序列均具有较高的保守性,仅在个别位置的碱基发生改变。本研究结果显示:此重复序列在一个菌株中也有广泛的分布,分布的位置遍布于菌株染色体基因组,差异也仅是个别的碱基。而此CRISPR中的间隔序列也具有较高的序列一致性,有的菌株中有多个间隔序列,这些间隔序列也同样具有较高的序列一致性。本研究结果显示:间隔序列中片段长度约为35 bp的序列在菌株中具有类似重复序列的分布特征,除了在该CRISPR位置上两者相邻,在其他位置上并未发现两者相邻。研究[15, 22]显示:CRISPR-Q1间隔序列两端序列与侧翼序列具有相同的序列。结合上述特征,对测序的志贺菌CRISPR-Q1序列进行BLAST结果提示:CRISPR-Q1序列中包含REP元素,仅含1个间隔序列的sf2457T中,存在4个REP序列。其他一些菌株包含多个重复序列和间隔序列。
本研究结果显示:CRISPR-Q1间隔序列数多的菌株中,常含有CRISPR1和CRISPR2。CRISPR-Q1序列中存在多个REP元素,这也提示REP元素与CRISPR之间存在一致性联系,CRISPR-Q1中间隔序列数影响REP元素的个数。REP序列稳定,REP-PCR技术可以对细菌进行鉴别和分型等[23],CRISPR中间隔序列的变化也为分析各型的特征提供了可能。尽管本研究并未采用此方法对志贺菌进行分型,但是CRISPR-Q1与REP元素间的一致性、CRISPR1和CRISPR2与CRISPR-Q1间的关联性以及CRISPR中间隔序列数目的多样性为其提供了理论基础。CRISPR和REP-PCR技术的联合应用可对志贺菌进行分型,REP-PCR可以对志贺菌进行初步的分型,CRISPR则可以对每个型别进行更为有效的分型,来阐述型别间的差异。在志贺菌中运用REP-PCR进行分型已有研究[24],其能很好地分析志贺菌各个菌株的遗传特点,但是并未对具有较近亲缘关系的菌株进行有效的分析。利用CRISPR的多样性特点,能够结合较近亲缘关系的菌株中CRISPR分布差异和间隔序列的数目对菌株类型以及特点进行多样性分析。
本研究观察了志贺菌中CRISPR-Q1的特点,初步探讨了CRISPR间的相关性。12株临床分离株研究结果也初步揭示了CIRSPR间的联系,但是还需要进行更深入的研究,同时还要探讨利用REP-PCR联合CRISPR对志贺菌或是其他细菌进行有效的分型,使其更好地揭示细菌的遗传特点以及变化特点。
[1] | Shariat N, Timme RE, Pettengill JB, et al. Characterization and evolution of salmonella CRISPR-Cas Systems[J]. Microbiology, 2015, 161(Pt2): 374–386. |
[2] | 杨海燕, 段广才, 张卫东, 等. 河南省睢县2001-2008年志贺菌群分布及其耐药分析[J]. 中华流行病学杂志, 2010, 31(3): 351–353. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2010.03.029 |
[3] | Wang Y, Song C, Duan G, et al. Transposition of ISEcp1 modulates blaCTX-M-55-mediated Shigella flexneri resistance to cefalothin[J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 42(6): 507–512. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2013.08.009 |
[4] | Yang H, Duan G, Zhu J, et al. Prevalence and characterisation of plasmid-mediated quinolone resistance and mutations in the gyrase and topoisomerase Ⅳ genes among Shigella isolates from Henan, China, between 2001 and 2008[J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 42(2): 173–177. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2013.04.026 |
[5] | Yang H, Sun W, Duan G, et al. Serotype distribution and characteristics of antimicrobial resistance in Shigella isolated from Henan province, China, 2001-2008[J]. Epidemiol Infect, 2013, 141(9): 1946–1952. DOI:10.1017/S0950268812002543 |
[6] | Palmer KL, Gilmore MS. Multidrug-resistant enterococci lack CRISPR-cas[J]. mBio, 2010, 1(4): e0022710. DOI:10.1128/mBio.00227-10 |
[7] | Cooper LA, Stringer AM, Wade JT. Determining the specificity of cascade binding, interference, and primed adaptation in vivo in the Escherichia coli type I-E CRISPR-cas system[J]. mBio, 2018, 9(2): e02100–17. |
[8] | Savitskaya E, Lopatina A, Medvedeva S, et al. Dynamics of Escherichia coli type I-E CRISPR spacers over 42000 years[J]. Mol Ecol, 2017, 26(7): 2019–2026. DOI:10.1111/mec.2017.26.issue-7 |
[9] | 张冰, 洪丽娟, 段广才, 等. 4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR/Cas系统变化[J]. 中华流行病学杂志, 2017, 38(2): 235–239. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2017.02.020 |
[10] | 张冰, 王鹏飞, 段广才, 等. CRISPR/Cas系统间隔序列同源质粒耐药信息与志贺菌耐药的关系[J]. 中国病原生物学杂志, 2016(10): 881–887. |
[11] | 洪丽娟, 张冰, 段广才, 等. CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响[J]. 微生物学报, 2016(12): 1912–1923. |
[12] | Krivoy A, Rutkauskas M, Kuznedelov K, et al. Primed CRISPR adaptation in Escherichia coli cells does not depend on conformational changes in the Cascade effector complex detected in vitro[J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(8): 4087–4098. DOI:10.1093/nar/gky219 |
[13] | Champer J, Liu J, Oh SY, et al. Reducing resistance allele formation in CRISPR gene drive[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(21): 5522–5527. DOI:10.1073/pnas.1720354115 |
[14] | 王鹏飞, 王颖芳, 段广才, 等. 志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析[J]. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(2): 343–349. |
[15] | 王鹏飞, 王颖芳, 段广才, 等. 志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析[J]. 吉林大学学报:医学版, 2015, 41(2): 261–268. |
[16] | Guo X, Wang Y, Duan G, et al. Detection and analysis of CRISPRs of Shigella[J]. Curr Microbiol, 2015, 70(1): 85–90. DOI:10.1007/s00284-014-0683-8 |
[17] | Wang P, Zhang B, Duan G, et al. Bioinformatics analyses of Shigella CRISPR structure and spacer classification[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2016, 32(3): 38. DOI:10.1007/s11274-015-2002-3 |
[18] | Yin S, Jensen MA, Bai J, et al. The evolutionary divergence of Shiga toxin-producing Escherichia coli is reflected in clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) spacer composition[J]. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(18): 5710–5720. DOI:10.1128/AEM.00950-13 |
[19] | Touchon M, Rocha EP. The small, slow and specialized CRISPR and anti-CRISPR of Escherichia and Salmonella[J]. PLoS One, 2010, 5(6): e11126. DOI:10.1371/journal.pone.0011126 |
[20] | Horvath P, Romero DA, Coute-monvoisin AC, et al. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus[J]. J Bacteriol, 2008, 190(4): 1401–1412. DOI:10.1128/JB.01415-07 |
[21] | 薛泽润, 王颖芳, 段广才, 等. 志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1和cas2研究[J]. 中华流行病学杂志, 2014, 35(5): 581–584. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.05.025 |
[22] | Strotskaya A, Savitskaya E, Metlitskaya A, et al. The action of Escherichia coli CRISPR-Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development strategies[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(4): 1946–1957. |
[23] | 赵燕梅, 张吉明, 许庆方. Rep-PCR技术及其应用现状[J]. 中国草食动物科学, 2014, 34(3): 55–57. |
[24] | Cao Y, Wei D, Kamara IL, et al. Multi-locus sequence typing (MLST) and repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction (REP-PCR), characterization of Shigella spp. over two decades in Tianjin China[J]. Int J Mol Epidemiol Genet, 2012, 3(4): 321–332. |