吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (05): 924-928

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阎慧, 马淑飞, 段明华, 闫玉礼, 潘新, 李海清, 周长龙, 赵天倚
YAN Hui, MA Shufei, DUAN Minghua, YAN Yuli, PAN Xin, LI Haiqing, ZHOU Changlong, ZHAO Tianyi
京尼平对胃癌SGC 7901细胞体外增殖、侵袭能力和凋亡的影响及其机制
Influence of genipin in abilities of proliferation and invasion and apoptosis of gastric cancer SGC 7901 cells and their mechanisms in vitro
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(05): 924-928
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(05): 924-928
10.13481/j.1671-587x.20180507

文章历史

收稿日期: 2018-01-07
京尼平对胃癌SGC 7901细胞体外增殖、侵袭能力和凋亡的影响及其机制
阎慧1 , 马淑飞2 , 段明华3 , 闫玉礼3 , 潘新4 , 李海清4 , 周长龙4 , 赵天倚3     
1. 长春中医药大学基础医学院生物化学教研室, 吉林 长春 130117;
2. 国药一心制药有限公司研发中心项目管理室, 吉林 长春 130022;
3. 长春中医药大学药学院生物制药与保健食品教研室, 吉林 长春 130117;
4. 空军航空大学飞行训练基地飞行二大队, 吉林 长春 130022
[摘要]: 目的: 探讨京尼平(GP)对胃癌SGC 7901细胞的调控作用,并阐明其作用机制点。方法: 取对数生长期的SGC 7901细胞,分为对照组和不同浓度(5、10、和20 mg·L-1)GP组,采用MTT法检测不同时间点(24、48和72 h)SGC 7901细胞体外增殖抑制率,应用Transwell小室细胞侵袭实验检测SGC 7901细胞体外侵袭能力,应用Western blotting法检测SGC 7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平。结果: MTT法检测,与对照组比较,作用不同时间后不同浓度GP组SGC 7901细胞增殖抑制率明显升高(P < 0.05);Transwell小室细胞侵袭实验,与对照组比较,作用72h后,10和20 mg·L-1GP组穿膜细胞数明显降低(P < 0.01);Western blotting法检测,与对照组比较,作用72 h后,20 mg·L-1GP组SGC 7901细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低(P < 0.01),caspase-3和Bax蛋白表达水平升高(P < 0.05)。结论: GP能够抑制SGC 7901细胞的体外增殖和侵袭能力,且能够诱导细胞凋亡,其机制可能与调节Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达有关。
关键词: 京尼平    SGC 7901细胞    细胞增殖    细胞侵袭    细胞凋亡    凋亡相关蛋白    
Influence of genipin in abilities of proliferation and invasion and apoptosis of gastric cancer SGC 7901 cells and their mechanisms in vitro
YAN Hui1, MA Shufei2, DUAN Minghua3, YAN Yuli3, PAN Xin4, LI Haiqing4, ZHOU Changlong4, ZHAO Tianyi3     
1. Derpartment of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
2. Sinopharm A-THINK Pharmaccutiacl Co., Ltd, Changchun 130022, China;
3. Department of Bio-pharmaceutics and Health food, College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
4. Flight Two, Aviation University of Air Force, Changchun 130022, China
[Abstract]: Objective: To investigate the regulatory effect of genipin (GP) on the gastric cancer SGC 7901 cells, and to clarify its mechanism. Methods: The SGC 7901 cells in logarithmic growth phase were selected and divided into control group and different concentrations (5.0, 10.0, and 20.0 mg·L-1) of GP groups.MTT was used to detect the inhibitory rates of proliferation of SGC 7901 cells at different time points(24, 48, and 72 h).Transwell chamber cell invasion assay was used to detect the invasion ability of SGC 7901 cells in vitro.The expression levels of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in the SGC 7901 cells were detected by Western blotting method. Results: The results of MTT assay showed that the inhibitory rates of proliferation of the cells in different concentrations of GP groups after treated with GP for different time were increased significantly compared with control group(P < 0.01).The Transwell cell invasion assay results showed that compared with control group, the number of transmembrane cells in 10.0 and 20.0 mg·L-1 GP groups was decreased significantly after treated for 72 h(P < 0.01).The results of Western blotting method showed that compared with control group, the expression level of Bcl-2 protein in 20.0 mg·L-1 GP group was decreased after treated for 72 h(P < 0.01), and the expression levels of caspase-3 and Bax proteins were increased (P < 0.05). Conclusion: GP can inhibit the abilities of proliferation and invasion in vitro of SGC 7901 cells, and induce the apoptosis; its mechanism may be related to the regulation of Bcl-2, caspase-3, and Bax protein expressions.
Key words: genipin     SGC 7901 cells     cell proliferation     cell invasion     apoptosis     apoptosis related proteins    

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,有明显的地域性差别。靶向治疗可针对性地杀伤癌细胞,减轻正常细胞损害。目前胃癌靶向治疗药物种类及作用均有限。靶向治疗药物主要有表皮生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、细胞凋亡促进剂和基质金属蛋白酶抑制剂等。京尼平(genipin,GP)的制备方法一般采用从栀子中提取京尼平苷(geniposide)[1],再用β-葡萄糖苷酶水解,然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得,也可以采用微生物转化法制备[2]。京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高,达到3%~8%,但由于栀子栽培容易、产量大,因此GP的生产主要以栀子为原料。GP来源于京尼平苷,在抗肿瘤、抗血栓、抗炎和治疗糖尿病等方面疗效显著,作为一种新兴的药物中间体具有很多新型的、重要的药理价值[3]。研究[4-6]表明:GP可有效抑制前列腺癌(AIPC)、肾癌细胞株(GRC-1)和前列腺癌细胞(PC-3)的增殖。但目前GP对胃癌SGC7901的影响尚不清楚,未见相关研究报道。因此,本实验通过检测GP对SGC7901细胞增殖、迁移和凋亡的影响,进一步探讨其对SGC7901细胞的促凋亡作用,阐明其对胃癌细胞抑制和促凋亡机制,为胃癌的临床治疗提供更多实验数据。

1 材料与方法 1.1 细胞、试剂和主要仪器

胃癌SGC7901细胞(湖南丰晖生物),RPMI培养基、胎牛血清、乙二胺四甲酸(EDTA)、胰蛋白酶、GP和噻唑蓝(MTT)(吉林省金泰生物试剂有限公司),全蛋白提取试剂盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(美国Sigma公司),PVDF膜(美国密理博公司)、β-actin、小鼠抗人Bcl-2抗体、小鼠抗人Bax抗体和小鼠抗人caspase-3抗体(美国BD公司)。Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞株培养

将细胞株复苏后,用含10%胎牛血清的高糖RPMI 1640培养基放置于37℃、5% CO2恒温培养箱培养。2~3 d传代1次,传代3次后,进行细胞实验。

1.3 细胞分组

经查阅文献[7]和预实验,初步确定GP浓度为10 mg·L-1。将胃癌SGC 7901细胞分为4组:对照(DMSO)组,低、中和高剂量(5、10和20 mg·L-1)GP组。

1.4 MTT法检测胃癌SGC 7901细胞增殖抑制率

取对数生长期细胞,用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,调整细胞密度为2×105 mL-1,接种于96孔板,接种量为每孔100 μL,培养24 h弃去培养基,加入3个药物实验组和DMSO对照组,每组药物3个复孔,每孔100 μL。放置于37℃、5% CO2恒温培养箱培养,分别培养24、48和72 h,于培养结束前4 h加入MTT(5 μg·L-1)20 μL,恒温培养箱内孵育4 h,于离心机2 500 r·min-1离心15 min,吸尽上清,加入DMSO 150 μL,100 r·min-1振荡10 min,用酶标仪测定吸光度(A)值,计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率= [1-实验组A(490)值/对照组A(490)值] × 100%。

1.5 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞,细胞密度稀释至2 × 105mL-1,根据MTT实验结果,选择MTT作用效果比较明显的GP浓度,加入细胞悬浮液中,使药物终浓度为10和20 mg·L-1。将GP加入RPMI 1640培养基中,使药物终浓度为10和20 mg·L-1,然后加入胎牛血清,使其浓度为10%。吸取200 μL含有不同浓度(10和20 mg·L-1)GP的细胞悬液接种于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的不同浓度(10和20 mg·L-1)GP的RPMI 1640培养基800 μL,同时设DMSO对照组,分别培养24、48和72 h后,去掉Transwell小室半透膜,PBS清洗2次,多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦拭去除半透膜上未穿透膜细胞,PBS清洗3次,普通显微镜下随机选取5个视野观察细胞并计数,以穿膜的细胞个数表示细胞的侵袭能力。

1.6 Western blotting法检测各组细胞中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达水平

在6孔细胞培养板,GP作用于细胞48 h后,弃去培养基,用PBS洗涤细胞2次。每孔加入RIPA裂解液100 μL,刮下底部细胞,吹打成单细胞悬液。根据BCA蛋白测定试剂盒(全蛋白提取试剂盒)要求,绘制标准曲线,并进行样品蛋白浓度测定。灌制4%浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳,PVDF膜转膜,封闭。分别加入Bax、Bcl-2和caspase-3-抗,4℃孵育过夜,室温摇床孵育2 h,漂洗3次,分别加入HRP标记的二抗,室温孵育2 h,漂洗3次。取膜,压片,检测,用分析软件Quanlity One分析目的条带的相对灰度值(以β-actin作为内参),以Bax/β-actin表示Bax蛋白表达水平,以Bcl-2/β-actin表示Bcl-2蛋白表达水平,以caspase-3/β-actin表示caspase-3蛋白表达水平[8]

1.7 统计学分析

采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率,穿膜细胞数和Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表达水平均以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MTT法检测各组SGC7901细胞增殖抑制率

不同浓度GP(5、10和20 mg·L-1)作用于胃癌SGC7901细胞24、48和72 h后,其增殖抑制率均升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.05),且呈时间-浓度依赖性。见表 1

表 1 各组SGC 7901细胞增殖抑制率 Table 1 Inhibitory rates of proliferation of SGC 7901 cells in various groups
(n=4, x±s, η/%)
Group Dose Inhibitory rate of proliferation of cells
(t/h)    24 48 72
Control 0 2.35±2.30 3.59±2.69 6.58±2.54
GP(mg·L-1) 5 11.18±3.11* 18.23±5.69* 23.19±3.12*
10 21.49±3.41* 28.21±3.15* 32.23±3.48*
20 41.08±1.15* 47.84±2.65* 50.56±2.72*
*P < 0.05 vs control group.
2.2 Transwell小室细胞侵袭实验检测SGC7901细胞穿膜细胞数

10和20 mg·L-1 GP作用于胃癌SGC7901细胞后,检测穿膜细胞数。Transwell小室检测结果:与对照组比较,10和20 mg·L-1 GP组穿膜细胞数明显降低(P < 0.05),且呈时间-浓度依赖性。见图 1(插页二)和图 2

A-C:24 h; D-F:48 h; G-I:72 h; A, D, G:Control group; B, E, H:10.0 mg·L-1GP group; C, F, I:20.0 mg·L-1GP group. 图 1 Transwell小室实验检测各组SGC7901细胞的侵袭能力 Figure 1 Invasion abilities of SGC7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay
*P < 0.05 vs control group. 图 2 Transwell小室实验检测各组SGC 7901细胞穿膜细胞数 Figure 2 Number of transmembrane SGC7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay
2.3 Western blotting法检测各组细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平

作用48 h后,与对照组比较,5、10和20 mg·L-1GP组SGC7901细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低(P < 0.05),Bax和caspase-3蛋白表达水平升高(P < 0.05)。见图 34

Lane 1:Control group; Lane 2-4:5, 10, and 20 mg·L-1 GP groups. 图 3 Western blotting法检测各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达电泳图 Figure 3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in SGC7901 cells in various groups detected by Western blotting method
*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. 图 4 Western blotting法检测各组SGC 7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 Figure 4 Expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method
3 讨论

癌症是一种复杂的疾病,单纯的靶向治疗并不能有效抑制肿瘤的生长和转移,通过药物来抑制细胞存活,也会导致药效变差,因此寻找能够调节肿瘤生存或凋亡的信号分子,是治疗肿瘤的关键[9]。本研究采用MTT法检测GP对胃癌SGC7901细胞的增殖调节作用与其浓度和时间的关系。本研究结果表明:培养24 h,当GP浓度为5 mg·L-1时,对细胞增殖抑制率仅为11.18%,随着给药浓度增加和给药时间延长,对胃癌细胞抑制作用逐渐增强;培养72 h,当浓度为20 mg·L-1时,对细胞增殖抑制率高达50.56%。本研究中Transwell小室细胞侵袭实验结果表明:与对照组比较,10和20 mg·L-1GP能明显降低胃癌SGC7901细胞的迁移和侵袭能力。Bcl-2基因家族及其相关蛋白Bcl-2是最早被发现与凋亡有关的基因[10-11],也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶[12],使用半胱氨酸裂解的多肽链中的硫原子切割caspase-3的活性形式,触发细胞凋亡[13]。裂解的caspase-3将最终诱导肿瘤细胞中DNA片段化,因此剪切后的caspase-3是很多化合物抑制肿瘤生长增加肿瘤凋亡的关键靶点[14]。而caspase-3在caspase家族中被认为是最重要的执行蛋白,在细胞死亡过程中常会出现caspase-3激活。因此,测定caspase-3蛋白水平变化[15],可以研究细胞凋亡机制。本实验中使用不同浓度GP(10和20 mg·L-1)作用于胃癌细胞48 h,检测胞内Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平[16],与对照组比较,GP在低浓度时就能够使Bax和caspase-3表达水平增加,且呈现一定浓度依赖性,而Bcl-2蛋白变化与此相反[17]

综上所述,GP能够上调Bax和caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,进而激活线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡[18]。本研究结果表明:GP对胃癌SCG7901细胞具有明显的增殖抑制作用,能够诱导细胞凋亡,但其具体作用机制有待进一步研究。

参考文献
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