胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，有明显的地域性差别。靶向治疗可针对性地杀伤癌细胞，减轻正常细胞损害。目前胃癌靶向治疗药物种类及作用均有限。靶向治疗药物主要有表皮生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、细胞凋亡促进剂和基质金属蛋白酶抑制剂等。京尼平(genipin，GP)的制备方法一般采用从栀子中提取京尼平苷(geniposide)^[1]，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备^[2]。京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%，但由于栀子栽培容易、产量大，因此GP的生产主要以栀子为原料。GP来源于京尼平苷，在抗肿瘤、抗血栓、抗炎和治疗糖尿病等方面疗效显著，作为一种新兴的药物中间体具有很多新型的、重要的药理价值^[3]。研究^[4-6]表明:GP可有效抑制前列腺癌(AIPC)、肾癌细胞株(GRC-1)和前列腺癌细胞(PC-3)的增殖。但目前GP对胃癌SGC7901的影响尚不清楚，未见相关研究报道。因此，本实验通过检测GP对SGC7901细胞增殖、迁移和凋亡的影响，进一步探讨其对SGC7901细胞的促凋亡作用，阐明其对胃癌细胞抑制和促凋亡机制，为胃癌的临床治疗提供更多实验数据。

胃癌SGC7901细胞(湖南丰晖生物)，RPMI培养基、胎牛血清、乙二胺四甲酸(EDTA)、胰蛋白酶、GP和噻唑蓝(MTT)(吉林省金泰生物试剂有限公司)，全蛋白提取试剂盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(美国Sigma公司)，PVDF膜(美国密理博公司)、β-actin、小鼠抗人Bcl-2抗体、小鼠抗人Bax抗体和小鼠抗人caspase-3抗体(美国BD公司)。Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司)。

将细胞株复苏后，用含10%胎牛血清的高糖RPMI 1640培养基放置于37℃、5% CO₂恒温培养箱培养。2~3 d传代1次，传代3次后，进行细胞实验。

经查阅文献^[7]和预实验，初步确定GP浓度为10 mg·L^-1。将胃癌SGC 7901细胞分为4组：对照(DMSO)组，低、中和高剂量(5、10和20 mg·L^-1)GP组。

取对数生长期细胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为2×10⁵ mL^-1，接种于96孔板，接种量为每孔100 μL，培养24 h弃去培养基，加入3个药物实验组和DMSO对照组，每组药物3个复孔，每孔100 μL。放置于37℃、5% CO₂恒温培养箱培养，分别培养24、48和72 h，于培养结束前4 h加入MTT(5 μg·L^-1)20 μL，恒温培养箱内孵育4 h，于离心机2 500 r·min^-1离心15 min，吸尽上清，加入DMSO 150 μL，100 r·min^-1振荡10 min，用酶标仪测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率= [1-实验组A(490)值/对照组A(490)值] × 100%。

用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞，细胞密度稀释至2 × 10⁵mL^-1，根据MTT实验结果，选择MTT作用效果比较明显的GP浓度，加入细胞悬浮液中，使药物终浓度为10和20 mg·L^-1。将GP加入RPMI 1640培养基中，使药物终浓度为10和20 mg·L^-1，然后加入胎牛血清，使其浓度为10%。吸取200 μL含有不同浓度(10和20 mg·L^-1)GP的细胞悬液接种于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的不同浓度(10和20 mg·L^-1)GP的RPMI 1640培养基800 μL，同时设DMSO对照组，分别培养24、48和72 h后，去掉Transwell小室半透膜，PBS清洗2次，多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦拭去除半透膜上未穿透膜细胞，PBS清洗3次，普通显微镜下随机选取5个视野观察细胞并计数，以穿膜的细胞个数表示细胞的侵袭能力。

在6孔细胞培养板，GP作用于细胞48 h后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞2次。每孔加入RIPA裂解液100 μL，刮下底部细胞，吹打成单细胞悬液。根据BCA蛋白测定试剂盒(全蛋白提取试剂盒)要求，绘制标准曲线，并进行样品蛋白浓度测定。灌制4%浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转膜，封闭。分别加入Bax、Bcl-2和caspase-3-抗，4℃孵育过夜，室温摇床孵育2 h，漂洗3次，分别加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，漂洗3次。取膜，压片，检测，用分析软件Quanlity One分析目的条带的相对灰度值(以β-actin作为内参)，以Bax/β-actin表示Bax蛋白表达水平，以Bcl-2/β-actin表示Bcl-2蛋白表达水平，以caspase-3/β-actin表示caspase-3蛋白表达水平^[8]。

采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率，穿膜细胞数和Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

不同浓度GP(5、10和20 mg·L^-1)作用于胃癌SGC7901细胞24、48和72 h后，其增殖抑制率均升高，与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)，且呈时间-浓度依赖性。见表 1。

10和20 mg·L^-1 GP作用于胃癌SGC7901细胞后，检测穿膜细胞数。Transwell小室检测结果：与对照组比较，10和20 mg·L^-1 GP组穿膜细胞数明显降低(P < 0.05)，且呈时间-浓度依赖性。见图 1(插页二)和图 2。

A-C:24 h; D-F:48 h; G-I:72 h; A, D, G:Control group; B, E, H:10.0 mg·L-1GP group; C, F, I:20.0 mg·L-1GP group. 图 1 Transwell小室实验检测各组SGC7901细胞的侵袭能力 Figure 1 Invasion abilities of SGC7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay

图选项

*P < 0.05 vs control group. 图 2 Transwell小室实验检测各组SGC 7901细胞穿膜细胞数 Figure 2 Number of transmembrane SGC7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay

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作用48 h后，与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1GP组SGC7901细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低(P < 0.05)，Bax和caspase-3蛋白表达水平升高(P < 0.05)。见图 3和4。

Lane 1:Control group; Lane 2-4:5, 10, and 20 mg·L-1 GP groups. 图 3 Western blotting法检测各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达电泳图 Figure 3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in SGC7901 cells in various groups detected by Western blotting method

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*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. 图 4 Western blotting法检测各组SGC 7901细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 Figure 4 Expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method

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癌症是一种复杂的疾病，单纯的靶向治疗并不能有效抑制肿瘤的生长和转移，通过药物来抑制细胞存活，也会导致药效变差，因此寻找能够调节肿瘤生存或凋亡的信号分子，是治疗肿瘤的关键^[9]。本研究采用MTT法检测GP对胃癌SGC7901细胞的增殖调节作用与其浓度和时间的关系。本研究结果表明：培养24 h，当GP浓度为5 mg·L^-1时，对细胞增殖抑制率仅为11.18%，随着给药浓度增加和给药时间延长，对胃癌细胞抑制作用逐渐增强；培养72 h，当浓度为20 mg·L^-1时，对细胞增殖抑制率高达50.56%。本研究中Transwell小室细胞侵袭实验结果表明：与对照组比较，10和20 mg·L^-1GP能明显降低胃癌SGC7901细胞的迁移和侵袭能力。Bcl-2基因家族及其相关蛋白Bcl-2是最早被发现与凋亡有关的基因^[10-11]，也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶^[12]，使用半胱氨酸裂解的多肽链中的硫原子切割caspase-3的活性形式，触发细胞凋亡^[13]。裂解的caspase-3将最终诱导肿瘤细胞中DNA片段化，因此剪切后的caspase-3是很多化合物抑制肿瘤生长增加肿瘤凋亡的关键靶点^[14]。而caspase-3在caspase家族中被认为是最重要的执行蛋白，在细胞死亡过程中常会出现caspase-3激活。因此，测定caspase-3蛋白水平变化^[15]，可以研究细胞凋亡机制。本实验中使用不同浓度GP(10和20 mg·L^-1)作用于胃癌细胞48 h，检测胞内Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平^[16]，与对照组比较，GP在低浓度时就能够使Bax和caspase-3表达水平增加，且呈现一定浓度依赖性，而Bcl-2蛋白变化与此相反^[17]。

综上所述，GP能够上调Bax和caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，进而激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡^[18]。本研究结果表明：GP对胃癌SCG7901细胞具有明显的增殖抑制作用，能够诱导细胞凋亡，但其具体作用机制有待进一步研究。