2011年日本福岛核电站泄漏事件后，辐射高本底环境是否影响人类健康再次引起广泛关注，其焦点是致癌问题。低剂量辐射(low dose radiation，LDR)的生物效应区别于高剂量诱导的损伤，但LDR诱导的效应仍不确定^[1-2]。LDR诱导的损伤效应主要依据是线性无阈模型(linear no threhold, LNT)，任何剂量的电离辐射都有致癌的可能性^[3-4]。但也有学者^[5-6]认为：LDR可诱导适应性反应和兴奋性效应。睾丸是辐射敏感的器官，极低剂量就能引起睾丸生精细胞凋亡^[7-8]，并且具有一定的剂量和时程-效应规律性。前期研究^[9]显示：LDR能够诱导小鼠睾丸生精细胞内质网应激的发生，并且启动了凋亡信号通路。肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1, IRE1)是一种定位在内质网膜的具有激酶和核酸内切酶活性的双功能酶，可以被内质网应激激活，从而激活多条下游信号通路，其中X盒结合蛋白1(X box-binding protein-1, XBP1)是最早发现并且最受关注^[10]，是重要的内质网应激信号调节通路。本实验旨在通过检测LDR后小鼠睾丸细胞中肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme-1α, IRE1α)、Total-XBP1(T-XBP1)、spliced XBP1(S-XBP1)mRNA及蛋白的表达，阐明IRE1-XBP1通路的激活在LDR诱导小鼠睾丸内质网应激信号调控中的作用。

50只健康雄性ICR小鼠，体质量(18±2)g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供，动物合格证号：SXCK(吉)203-00007，随机分为10组，每组5只。时程-效应实验为75 mGy照射后0、3、6、12和24 h处死动物，剂量-效应实验为0、50、75、100和200 mGy照射后12 h处死动物。应用国产固定式X射线深部治疗机(XSZ-220/20X型，丹东市康嘉仪器设备有限公司)进行全身照射，电压180 kV，电流15 mA，剂量率为12.5 mGy·min^-1。

TRIzol(美国Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC, 上海生工生物公司)，反转录试剂盒(加拿大MBI Fermentas公司)，IRE1α、T-XBP1、S-XBP1和GAPDH引物及real time PCR试剂盒(大连宝生物公司)，ECL发光试剂盒, IRE1α、T-XBP1、S-XBP1(兔抗鼠多克隆)和GAPDH(山羊抗鼠多克隆)一抗(美国Santa Cruz公司)，辣根过氧化酶标记的抗兔及抗山羊二抗(北京中杉金桥公司)，其他试剂为国产分析纯；PCR仪(美国Perkin-Elmer公司)，Mx3000P real time PCR仪(美国Stratagene公司)，Mini-PROTEAN 3 Dodeca微型电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

IRE1α引物：5′-CATGAGGAACAAGAAGCACCACTA-3′(上游序列)，5′-TCGCTGTGTGAAGTACTGAATGAA-3′(下游序列)；T-XBP1引物：5′-TGGGCATTCTGGACAAGTT-3′(上游序列)，5′-GAAAGGGAGGCTGGTAAGG-3′(下游序列)；S-XBP1引物：5′-CTGAGTCCGAATCAGGTGCAG-3′(上游序列)，5′-GTCCTAGGGAAGATGTTCTGG-3′(下游序列)；GAPDH引物：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′ (上游序列)，5′- TGAAGGGGT-CGTTGATGG-3′(下游序列)。用TRIzol试剂提取各组睾丸细胞中总RNA后，采用反转录试剂盒合成互补DNA(cDNA)，MX3000P real time PCR系统进行PCR扩增并分析。每组随机选择5只小鼠左侧睾丸样本，每个样本设3个复孔。每个样本的mRNA表达水平用各自内参照GAPDH表达水平进行标准化，以目的mRNA与GAPDH mRNA比值为该基因的相对表达水平，同时将对照组目的mRNA相对表达水平设定为1^[8]。

将上述5只小鼠右侧睾丸组织提取总蛋白并进行蛋白定量。每个样品取20 μg上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，浓缩胶采用60 V恒压，分离胶采用90 V恒压。蛋白转移至硝酸纤维膜上，膜经新鲜配制的封闭液(1×TBS，5%脱脂奶粉，0.05% Tween-20)常温封闭1 h，加入按一定比例稀释后的IRE1α、T-XBP1、S-XBP1和GAPDH一抗，4℃过夜，用含0.05% Tween 20的TBST洗涤2次，每次15 min，加入按一定比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37℃震荡孵育1 h；用ECL发光试剂盒进行发光，X射线片曝光显影，照相后进行分析，结果以条带灰度值表示蛋白表达强度。实验重复3次。

采用SPSS24.0统计软件进行统计学分析。小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1mRNA表达水平以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

除3 h组小鼠睾丸细胞中T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平降低外，其他各时间组IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平均随时间延长而升高，并在6 h达到峰值，而后逐渐降低。与0 h组比较，6、12和24 h组小鼠睾丸细胞中IRE1αmRNA表达水平及6和12 h组T-XBP1、S-XBP1mRNA表达水平均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；与0 h组比较，不同时间组IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度增加，6和12 h组IRE1α蛋白表达强度及24 h组S-XBP1蛋白表达强度最高，而T-XBP1蛋白表达强度稍有降低。见表 1和图 1。

Lane 1:0 h group; Lane 2:3 h group; Lane 3:6 h group; Lane 4:12 h group; Lane 5:24 h group. 图 1 Western blotting法检测75 mGy X射线照射后不同时间各组小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1蛋白表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of IRE1α, T-XBP1 and S-XBP1proteins in mouse testis cells at different time after 75 mGy X-ray irradiation in various groups detected by Western blotting method

图选项

0~200 mGy X射线全身照射后12 h，随照射剂量的增加，各组小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平升高，75 mGy组升高达峰值后逐渐降低，甚至降至0 mGy组以下。与0 mGy组比较，75和200 mGy组小鼠睾丸细胞中IRE1αmRNA表达水平、75 mGy组T-XBP1和S-XBP1mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。与0 h组比较，各剂量组小鼠睾丸细胞中IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度升高，75 mGy组IRE1α蛋白表达强度、75和200 mGy组S-XBP1蛋白表达强度升高最明显，而T-XBP1蛋白表达强度无明显变化。见表 2和图 2。

Lane 1:0 mGy group; Lane 2:50 mGy group; Lane 3:75 mGy group; Lane 4:100 mGy group; Lane 5:200 mGy group. 图 2 Western blotting法检测不同剂量X射线照射后12 h各组小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1蛋白表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of expressions of IRE1α, T-XBP1 and S-XBP1 proteins in mouse testis cells 12 h after different doses of X-ray irradiation in various groups detected by Western blotting method

图选项

随着核电和核技术应用越来越广泛，由此产生的辐射对人体健康的影响也日渐增加，尤其是LDR所引发的问题已经成为放射医学领域的研究热点。过去20多年来，LDR的生物学效应特别是导致生殖及遗传效应引起诸多研究者的关注。睾丸组织是辐射敏感器官，睾丸细胞群主要包括精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子，以及Lydig和Sertoli细胞；其中，精原细胞及精母细胞对辐射敏感，而精子细胞和精子以及Lydig和Sertoli细胞则表现为辐射抵抗。因此，LDR诱导睾丸细胞的凋亡以精原细胞和精母细胞为主，很少涉及到精子细胞和精子以及Lydig和Sertoli细胞，这一点本研究前期的相关研究已经证实^[7]。睾丸组织是辐射敏感器官，低至100 mGy的单次剂量照射损伤分裂中的精原细胞，导致生精障碍^[11-12]。在放射治疗中睾丸组织分次照射生精小管损伤也会增加，主要可能是由于干细胞的重复激活导致的，对于生精上皮来说，多种低程度的遗传损伤甚至比高程度的损伤更严重^[13]。因此，研究LDR对睾丸生殖损伤则有望提出相应的新理论和新机制。

内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠和分泌的重要细胞器，内质网内环境的稳定是实现内质网功能的基本条件, 因此内质网具有极强的内稳态体系。在氧化应激、缺氧和电离辐射等条件下，内质网内未折叠和错误折叠的蛋白明显增多，超出了内质网处理能力时，细胞会激活相关的信号级联反应来应对条件的变化，并恢复内质网良好的环境，这种情况被称为内质网应激，当应激发生程度较低时则细胞可以正常分裂，恢复生命；而当应激过载时则激活下游凋亡通路信号分子，诱导细胞凋亡。参与内质网应激的信号调控的3个重要的跨膜蛋白分别为：双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor-6，ATF6)和IRE1，均可与下游相应的分子构成独立的或互为网状的信号通路。IRE1被激活后能够切割下游XBP1 mRNA(T-XBP1)形成切割体mRNA(S-XBP1)，进而导致该通路的激活^[14-18]。本课题组前期研究显示：LDR能够诱导睾丸细胞发生内质网应激，并且激活了PERK-CHOP凋亡通路^[8]，但是内质网应激能否激活ATF6和IRE1通路尚不明确。本实验通过检测75 mGy照射后0~24 h和0~200 mGy照射后12 h各组小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平及蛋白表达强度变化来判断发生内质网应激的可能，结果显示：75 mGy照射后0~24 h，随着时间延长，小鼠睾丸细胞中IRE1α mRNA表达水平及蛋白表达强度逐渐增加，分别在6和/或12 h达到峰值而后降低；T-XBP1和S-XBP1与IRE1α mRNA表达时程变化趋势相似，S-XBP1蛋白随时间延长逐渐增加，但是在照射后24 h表达最高，而T-XBP1蛋白表达有降低趋势但不明显；0~200 mGy照射后12 h，随着剂量的增加，小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平的变化趋势基本一致，即75 mGy照射后其表达水平最高，而后逐渐减低甚至降至0 mGy组水平以下。IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度分别在75和200 mGy照射后达最强，而T-XBP1蛋白表达强度无明显的变化。本研究结果表明：LDR能够诱导小鼠睾丸细胞中IRE1α mRNA表达水平及蛋白表达强度增加，进而切割T-XBP1 mRNA形成S-XBP1 mRNA。理论上T-XBP1 mRNA被切割后其表达减少，但是其表达也随着时间延长而增加，可能与辐射后时间不同有关^[19-20]。本研究结果提示：LDR能够诱导小鼠睾丸细胞IRE1-XBP1内质网应激通路的激活。本结果为研究LDR诱导睾丸细胞凋亡机制提供了必要的补充，为电离辐射防护政策和法规的制订提供了实验数据。