阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)又称原发性老年性痴呆症，是一种以记忆力损害和进行性认知功能障碍为主的慢性中枢神经系统退行性疾病。患者脑组织尤其是海马区出现大量老年斑(senile plaques，SP)是其主要病理学特征之一。大量研究^[1-2]证实：β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是SP的主要毒性成分。Aβ有神经毒性，其在脑内沉积可引发一系列的病理反应，如突触功能异常、神经元细胞减少和记忆力损害等。因此，Aβ的产生和清除障碍会导致其在脑内过度沉积，被认为是AD最重要的致病因素，因此清除脑内Aβ是目前防治AD的重要策略之一^[3]。白细胞介素33(interleukin-33，IL-33)是2005年被发现的一种多功能蛋白质，其基因序列和结构与IL-1家族成员IL-18和IL-1β相似，是IL-1家族的一个重要成员^[4]。Chapuis等^[5]研究发现：与正常人比较，AD患者脑内的IL-33表达水平明显降低，IL-33表达水平的降低又可明显增加患AD的风险，同时IL-33能通过调节转录过程减少细胞内Aβ的生成。IL-33降低细胞内Aβ水平是否与其参与脑内Aβ清除过程有关目前尚未见相关报道。本课题组一直致力于IL-33促进脑内Aβ清除的研究，本实验采用皮下注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝(AlCl₃)的方法建立AD大鼠模型，观察IL-33对AD模型大鼠脑内Aβ1-40及Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)水平的影响，初步探讨IL-33在脑内Aβ清除过程中的作用及机制，为更好地研发新的抗AD药物提供理论依据。

健康SD大鼠70只，雄性，体质量200~300 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司中心提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2014-0007，标准鼠饲料常规喂养。D-半乳糖购于上海源聚生物科技有限公司，AlCl₃购于天津福晨化学试剂厂，IL-33、Aβ和Th2检测试剂盒由厦门慧嘉生物科技有限公司提供。分析天平购于北京赛多利斯系统仪器有限公司，大鼠跳台仪购于成都泰盟科技有限公司，Morris水迷宫购于中国医学科学院药物研究所，脑立体定位仪(DW-5)购于成都泰盟科技有限公司，南韩牙科手机(STRANG 90)购于咸阳西北医疗器械有限公司，匀浆机(IKAR 104)购于上海高鸽工贸公司，离心机购于北京医用离心机厂，Thermo MK3酶标仪购于上海赛默科技生物发展有限公司。

雄性SD大鼠70只，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组，模型组，假手术组，极低、低、中和高剂量IL-33组(0.01、0.10、1.00和10.00 mg·L^-1)，每组10只，除正常对照组外，其余各组大鼠均皮下注射D-半乳糖125 mg·kg^-1·d^-1和灌胃AlCl₃ 500 mg·kg^-1·d^-1，连续60 d。正常对照组等量皮下注射生理盐水和双蒸水灌胃。

末次给药的第2天，将正常对照组和模型组大鼠逐只放入大鼠跳台箱中，先适应3 min，然后通电5 min(给定电压为38 V)，使大鼠学习逃避被电击。24 h后进行记忆测试，以大鼠跳下平台双足接触铜栅为错误反应，记录大鼠5 min内的错误次数和首次出现错误的潜伏期。

Morris水迷宫选用大鼠通用型，水池直径100 cm，高度40 cm，水深25 cm，水温22℃~24℃，水中加入豆奶粉，使其呈不透明状。水迷宫正中放置高度23 cm、直径8 cm的平台，没入水下2 cm，迷宫外参照物保持固定。采用Morris水迷宫实验进一步判断大鼠学习记忆能力，实验方法参照文献^[6]。①定位航行实验：第1天先让大鼠自由游泳2 min，第1天第2次即开始训练，随后每天训练4次，每次间隔2 h，共训练4 d。训练时选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在120 s内找到平台，记录120 s内实际逃避潜伏期；如在120 s内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为120 s。②空间探索实验：定位航行实验结束后的次日进行空间探索实验。撤去平台，让大鼠从原平台象限的对侧象限入水，观察记录大鼠在原平台象限停留的时间和游泳的距离，以判断大鼠记忆存储及提取再现能力。

将各剂量IL-33组大鼠腹腔注射20%乌拉坦(5 mL·kg^-1)进行麻醉后，用DW-5脑立体定位仪固定头部，头部剪毛后碘伏消毒，头颅正中剪开2 cm纵向切口，用刀片刮去骨膜，暴露前囟，用微量进样器进行前囟零点定位，记录前后、左右、上下读数，于前囟后3 mm，中线左右各旁开2.2 mm，用牙科手机钻开左右颅骨，针头消毒，用微量进样器垂直进针3.3 mm，左右缓慢注射IL-33 1 μL，5 s注入，留针5 min后缓慢拔针，缝合伤口。假手术组大鼠同一位置注射等量生理盐水做对照。

正常对照组和模型组大鼠断颈处死，直接取脑组织。其余各组大鼠手术24 h后断颈处死，立即取脑组织。脑组织用4℃冰冷生理盐水冲洗，吸干，称质量，冷冻保存。加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，匀浆机匀浆，3 000 r·min^-1离心20 min后，仔细收集上清，准备待测。剩余的脑组织封好后放到冰箱里冷冻待用。

配置浓度分别为600、600、400、400、200、200、100、100、50和50 μg·L^-1的10份标准液，参照酶联免疫分析试剂盒说明书加样，显色，以波长450 nm测定各孔的吸光度(A)值，以标准品浓度为横坐标，对应A值为纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，计算出标准曲线的线性回归方程式，将样品的A值代入方程，计算出样品，再乘以稀释倍数，即为样品的实际水平，即Aβ水平，单位：μg·L^-1。将脑组织从冰箱里取出后反复冻融，用匀浆机依次匀浆，3 000 r·min^-1常温高速离心，离心后取上清液备用。按照酶联免疫分析试剂盒的说明书操作，应用Thermo MK3酶标仪测定大鼠脑组织内细胞因子Th2水平并记录数据。测定方法同Aβ，单位：μg·L^-1。

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。跳台实验中大鼠潜伏期和错误次数，Morris水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间和游泳距离，大鼠脑组织中Aβ1-40和Th2水平均以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组比较，模型组大鼠在跳台实验中的错误次数增多(t=8.154，P＜0.01)，潜伏期明显缩短(t=4.579，P＜0.01)。见表 1。

在定位航行实验中，2组大鼠逃避潜伏期随着训练时间的延长逐渐缩短，第1~4天，模型组大鼠逃避潜伏期较正常对照组明显延长(t=27.810，P＜0.01；t=17.731，P＜0.01；t=30.961，P＜0.01；t=25.159，P＜0.01)。见表 2。与正常对照组比较，模型组大鼠在目标象限内滞留时间和游泳距离明显缩短(t=3.767，P＜0.01；t=1.973，P＜0.05)。见表 3。

与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织中Aβ水平明显升高(t=3.222，P＜0.05)。低、中和高剂量IL-33组大鼠脑组织中Aβ水平较模型组明显降低(F=9.866，P＜0.05)，极低剂量IL-33组和假手术组大鼠脑组织中Aβ水平与模型组比较差异无统计学意义(t=8.527，P＞0.05；t=2.028，P＞0.05)。见表 4。IL-33量效之间基本符合正态分布。

与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织中的Th2水平明显降低(t=4.646，P＜0.01)。与模型组比较，给药组大鼠脑组织中的Th2水平明显升高(F=3.620，P＜0.05)，极低剂量IL-33组和假手术组大鼠脑组织中的Th2浓度与模型组比较差异无统计学意义(t=1.459，P＞0.05；t=0.326，P＞0.05)。见表 4。IL-33量效之间基本符合正态分布。

D-半乳糖可导致大鼠亚急性衰老，大量D-半乳糖进入动物体内，在半乳糖氧化酶的催化下，代谢为CO₂和木酮糖，同时产生过量的超氧阴离子自由基(O^2-)，过量的自由基在动物体内不仅损害生物膜系统，还影响核酸和蛋白质的代谢，加重细胞损伤，短期内可导致大鼠机体多器官、多系统功能衰退，同时也可引起大脑神经元的一系列退行性改变^[7]。研究^[8-9]表明：AD患者脑组织中铝水平是正常人的20~30倍，过量的铝在脑组织中蓄积可参与神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)和SP的形成，引起中枢神经系统退行性病变。D-半乳糖和AlCl₃可在基因水平调控淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)和β-内分泌酶基因，使其表达水平增加，导致Aβ在脑组织过度沉积^[10]。本研究行为学检测结果显示：模型组大鼠在跳台实验中错误次数明显增多，潜伏期明显缩短；在Morris水迷宫实验中，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，在目标象限停留时间和游泳距离明显缩短，表明模型组大鼠的记忆已出现障碍，学习记忆能力明显下降。通过测定大鼠脑组织内Aβ浓度显示：模型组大鼠脑组织内Aβ水平较正常对照组明显升高。以上结果提示：本研究实验动物模型已经造模成功，D-半乳糖联合AlCl₃制作的AD大鼠模型较好地模拟了AD患者学习记忆障碍和病理学方面的特征，是目前筛选AD治疗药物靶点的一种较为理想的动物模型。

β-淀粉样前体蛋白(amybid precursor protein，APP)是一种在多组织细胞中表达的跨膜糖蛋白，尤以脑组织中水平最高。在正常的生理条件下，APP主要经α-分泌酶和γ-分泌酶剪切产生可溶的P3肽段和APP细胞内结构域(APP intracellular domain，AICD)，不产生Aβ，只有少量的APP经β-分泌酶和γ-分泌酶剪切产生Aβ。而病理状态下β-分泌酶基因会过度表达，促使APP更多地经β-分泌酶途径代谢形成Aβ，凝聚状态的Aβ会迅速在神经元之间集聚，形成SP^[11]。SP具有神经毒性作用，可导致神经元细胞功能紊乱甚至凋亡坏死，诱发或加重老年性痴呆。

Aβ是AD重要的致病物质，研究^[12]显示：AD患者脑内IL-33表达水平明显低于正常人。此外，IL-33可降低神经细胞分泌的Aβ，IL-33对于AD可能是一个神经保护因子。IL-33可能通过增强神经胶质细胞吞噬Aβ，即通过增加对Aβ的清除来保护大脑神经元免受损伤^[13]。本研究中ELISA法检测结果显示：模型组大鼠脑组织中Aβ水平较正常对照组明显升高，低、中和高剂量IL-33组大鼠脑组织中Aβ浓度较模型组明显降低，与以上研究结果相符，也在一定程度上证明了上述观点。

正常情况下，神经胶质细胞、巨噬细胞、树突状细胞都可以吞噬Aβ^[14-15]，Aβ在其中加工后，与MHC分子相互识别，激活Th0，提高Th2细胞因子的表达水平，使得Th2生成增多。然后，B细胞在IL-4和Th2协助下活化产生特异性抗体并与可溶性Aβ结合后，促进Aβ降解^[16]。研究者^[17-18]发现：IL-33对于Th2的免疫应答具有十分重要的作用，其通过作用于Th2细胞ST2受体增强Th2免疫应答能力，增加Th2的生成，从而促进B细胞活化产生特异性抗体降解Aβ。本研究中ELISA法检测结果显示：与正常对照组比较，模型组大鼠脑内的Th2水平明显降低，低、中和高剂量IL-33组大鼠脑内的Th2水平较模型组明显升高，但极低剂量IL-33组和模型组比较差异无统计学意义。本研究结果表明：IL-33可能通过增强Th2免疫应答能力产生特异性抗体来增加脑内Aβ的清除而发挥抗AD作用，但其具体机制还需进一步研究。