2. 吉林建筑大学基础部, 长春 130118
2. Department of Basic Science, Jilin Jianzhu University, Changchun 130118, China
0 引言
电产甲烷(electromethanogenesis)[1]作为一种厌氧条件下能彻底降解有机质的新技术，可就地利用被处理物质中的化学能而降低处理过程的能耗；其在生物能(CH4)生产、废水处理、地下水修复、土壤及沉积物修复等能源环境领域展现出来的应用潜力，使其在解决全球变暖和许多其他能源环境问题上被寄予厚望。生物阴极的低活性[2-8]提高了微生物电解池的运行成本，限制了其应用发展。寻找简捷的方法获取高活性的生物阴极成为当前应用该技术的一个突出问题。
构建和运行成本低的单室无膜微生物电解池(SCMMEC)不仅设计简单、容易制造，而且运行控制简单、易放大，被认为是最有应用潜力的反应器类型，故以其为反应器的研究具有较高的应用价值。徐恒等[5, 9]在葡萄糖双室反应器的阴极电势为-0.75 V(相对于标准氢电极)时获得了活性为2.34 A/m2的产甲烷(methanogenesis)生物阴极，在阴极电势为-0.70 V(相对于标准氢电极)时所获产甲烷生物阴极的活性为1.00 A/m2。反应器的类型是影响生物膜电活性的重要因素之一[10]。SCMMEC为生物电极提供的生存空间不同于双室结构。到目前为止，尚未见到以葡萄糖为碳源，评估通过SCMMEC获取产甲烷生物阴极的报道。因此，为获取高活性的生物阴极，本试验以葡萄糖作为可发酵物质的代表，对SCMMEC阴极上生物膜的电活性进行了确认, 并评估了所富集生物阴极在无外加氧化还原介体环境中应用的可行性以及生物阴极的相对活性。此外，生物阴极的长期稳定性是其能否应用的又一重要指标。已有研究中尚无考察葡萄糖SCMMEC产甲烷生物阴极长期稳定性的报道。考虑到实际废物流的低缓冲能力，本试验还考察了低剂量磷酸盐缓冲剂合成废水中生物阴极长期运行的稳定性。
1 材料和方法 1.1 装置及仪器将3个有效容积均为115 mL的玻璃瓶(编号分别为MEC1、MEC2和MEC3) 用橡胶塞密封构建成单室无膜反应器。在每个反应器的橡胶塞上插入3根石墨棒电极(石墨棒电极供微生物生长的几何面积为0.001 m2, 吉林宏远碳棒有限责任公司), 其中1个为阳极，其余2个为阴极，分别连接定制的直流电源，外压0.4 V。反应器中的阳极为在实验室的其他装置中启动好的生物阳极，2个阴极为新鲜石墨棒。反应器产生的气体经水封离开容器。MEC1和MEC3用于验证阴极为生物阴极，MEC2用于考察生物阴极的长期稳定性。
电极在使用之前均用砂纸(型号360，湖北玉立砂带有限责任公司)打磨，并用蒸馏水冲洗。饱和甘汞电极(0.242 V，相对于标准氢电极, 型号232，雷磁，上海精密科学仪器有限责任公司)为参比电极，用以进行电极电势的测量。反应器运行过程中的电流、电极电势以及施加在电极上的外压由在线的万用表(UT71D, 优利得，香港优利得有限责任公司)实时记录监控。反应器避光运行，水浴控制在(24±1)℃。电流密度由生物阴极的几何面积换算而得到。pH通过pHS-3C酸度计(上海，雷磁)测定。
1.2 合成溶液及废水反应器运行用到的溶液有溶液M1和溶液M2。这两种溶液都含有如下组分：K2HPO4·3H2O (1.43)、NaH2PO4·2H2O (0.98)、NH4Cl (0.31) g/L。M1由不含余氯的自来水和上述组分构成，并在4 ℃储存备用，储量50 L；M2由含余氯(0.05~0.10 mg/L)的自来水和上述组分构成，现用现配。合成废水(0.25 g /L)由适量的葡萄糖溶解到一定量的M1中配成，现用现配。所用试剂均为分析纯试剂(天津福晨)。
1.3 启动和运行反应器启动用的10 mL种源(体积比为10%), 来自于实验室内已运行2年多的微生物电解池。这些装置最初的启动种泥为长春市西郊污水处理厂的回流污泥。装置的启动和运行采用批式运行模式。预试验表明溶液中少量溶解的O2对电流密度的重现性无影响，因此试验过程中没有采取措施将反应介质中的O2加以去除。反应器顶部空间的O2用N2(99.999%)吹脱10 min去除。启动过程中每天检查2次反应介质的pH值。为尽可能保证测定结果的一致，对62、153和275 d生物阴极进行的活性确认所用生物阳极均为在相同条件下新启动62 d的生物阳极。
1.4 生物阴极的确认首先采用电压扫描[11]确认阴极上的生物膜具有电活性。预试验表明：将阴极生物膜置于密封的M1中4 h后，其电活性没有下降的趋势；但是将阴极生物膜置于密封的M2中4 h后, 其活性有明显下降。自来水中的余氯具有灭活生物膜中细菌的能力[12]，因此，比较阴极生物膜经M1和M2作用后的电压扫描差异，可确认阴极生物膜对阴极电活性有明显的影响。这种差异是由电活性生物膜活性下降所致，可帮助确认阴极上的生物膜具有电活性，并用电流限制电极[13]的定义来判断阴极生物膜的相对活性水平。
接着，为进一步证明阴极生物膜有电活性，将MEC3中阴极上的生物膜用滤纸抹去，比较抹去前后的电压扫描结果。
2 结果与讨论 2.1 阴极生物膜的电活性首先对2个培养62 d的阴极生物膜进行3次电压扫描；然后将其置于M2中灭活4 h；最后对2个被灭活的阴极生物膜进行1次电压扫描作为参照, 结果见图 1。由图 1可知：在电压扫描范围内，阴极生物膜的表现无论从电流密度还是阴极电势来看，均明显好于参照电极；外压为0.80 V时，两个阴极生物膜的电流密度分别达到0.59和0.62 A/m2；而经4 h余氯灭活后作参照的两个电极的电流密度却仅有0.40和0.39 A/m2。参照电极的电活性明显低于阴极生物膜的电活性，这可能源于被灭活后生物膜中电活性微生物的数量减少、活性下降，或电子传递途径受到损伤所致。电压扫描表明该系统中的阴极生物膜具有电活性。
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| 图 1 阴极生物膜和参照电极的电压扫描图 Figure 1 Voltage scans with cathodic biofilms and inactivated cathodic biofilms in the SCMMEC |
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为进一步证明阴极的生物膜具有电活性，用滤纸将MEC3中的一个阴极生物膜抹去, 并比较抹去前后电极的电活性，结果见图 2。由图 2a可知，电极抹去生物膜前后产生的电流密度有明显差异:在外压＜0.67 V时，抹去生物膜的电极有较高的催化活性，而有生物膜的电极则催化活性较低，这与启动阶段新鲜石墨棒活性较高一致; 但在外压>0.67 V时，抹去生物膜的电极催化活性低，而有生物膜的电极催化活性高，较高的催化活性应来自生物膜的催化作用。由图 2b可知，有生物膜的阴极电势始终低于无生物膜的阴极。这可能与去膜电极上残留的微生物以及因生物膜遭到破坏导致的电极活性下降有关。
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| 图 2 阴极生物膜抹去前后的电压扫描图 Figure 2 Voltage scans with cathodic biofilm and without cathodic biofilm in the SCMMEC |
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Fu等[14]对噬热(55 ℃)产甲烷生物阴极的研究发现，经双室160 h的设定电势-0.5 V(相对于标准氢电极)驯化后，生物阴极的活性提高了近6倍。徐恒等[5]利用葡萄糖双室反应器在阴极电势为-0.75 V(相对于标准氢电极)时获得的产甲烷生物阴极的活性达到(2.34±0.15) A/m2。反应器的双室与单室结构为生物电极提供的生存空间具有很大的差异。从反应器的构型来看，本试验获得的2个生物阴极在阴极电势为-0.79~-0.78 V(相对于标准氢电极)时的电流密度按阴极投影面积计算可达到0.78~1.09 A/m2，低于徐恒等[5]的结果，但该趋势与Fu等[14]的发现相一致。
2.2 电流限制电极在工程应用中，阴阳极的活性匹配程度影响着设计中阴阳极的面积比，进而影响单位体积内的有效电极面积，影响反应器的处理能力和固定成本。因此，在微生物电解系统的开发过程中，确认电流限制电极是一项非常重要的工作。由图 3可知，当外加电压从0.5 V增加到0.8 V时，增量为0.3 V：阴极电势从-0.94 V降到-1.16 V，相对变化量为0.22 V；而阳极电势则从-0.45 V左右上升到-0.34 V，相对变化量为0.11 V。阴极电势的相对变化量大于阳极电势的相对变化量，因此生物阴极为阴阳电极对中的电流限制电极。
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| 图 3 电压扫描过程中阴阳极电势跟踪 Figure 3 Anodic and cathodic potentials with voltage scans |
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受介体成本、可能的毒性以及出水排放标准的限制，对于在电活性微生物和电极间依靠介体传递电子的体系来说，其运行不具有可持续性；而依靠直接接触和纳米线传递电子的传递方式，其不受介质中介体有无的影响，这样的微生物电解系统具有很强的实用价值[15]。以葡萄糖为碳源的生物电化学系统中可能含有较高溶解性的微生物分泌物[16]，这些溶解性微生物分泌物中的部分物种有可能起电荷传导介体的作用，从而导致电荷传导介体流失时处理效能下降。为了澄清这一问题，两个生物阴极在运行60 d后，进行了电子传递介体的影响测试。由图 4可知，2个生物阴极在介质中的有机碳源耗尽后，全部更换溶液(箭头指示完全更换新介质)，微生物电解池立即产生与前一周期电流大小相当的电流，没有任何下降的迹象。这表明介质中可能的电子介体和浮游生物对电流的产生无影响，电极上的生物膜与电极间的电子交换是电流的主要来源。当外压为0.4 V时，反应器稳定运行的阴极电势≥-0.59 V(相对于标准氢电极)，阴极为产甲烷生物阴极(>-0.70 V(相对于标准氢电极)的产甲烷电势[9])，进水中的一部分COD通过阴极产甲烷被去除。
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| 图 4 生物阴极微生物电解池连续完全更换介质的电流跟踪 Figure 4 Current production with completely medium replacement |
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生物阴极的稳定性评价是判断生物阴极能否实用的一个重要步骤。在微生物电解过程中，阳极氧化反应产生H+和电子，阴极还原反应消耗H+和电子。电子在外压的作用下很快就能从阳极到达阴极。为保持电中性，需要溶液中等量电荷的阳离子从阳极迁移到阴极。理想状态下，需等量电荷的H+以电子转移的同等速度从阳极迁移到阴极，这样就不会在阴阳极间产生pH差。实际上，由于H+迁移慢[17]、浓度低，特别是溶液中其他高浓度阳离子的参与[18]，致使阴阳极均偏离中性(阳极向偏酸性发展，阴极向偏碱性发展)，两极间产生pH差。这种情况的发生往往导致许多问题发生，如阴阳极偏离中性会使细菌活性下降[17]，增加系统的能耗损失(ΔE =0.592pH，298 K)[19]，碱性侧发生盐沉积、降低生物阴极的活性[20]等。基于以上认识，无膜反应器在消除两极pH极化、降低能耗损失上有明显效果，被寄予厚望，但仍然不能完全防止阴阳极附近局部偏离中性产生的pH极化[21]。生物阴极可自我繁殖的特点使其被寄予可长期稳定运行的期望。在单室无膜反应器中局部偏离中性的pH极化是否影响生物阴极的长期稳定运行，尚无这方面的报道。为此，我们在外加低剂量缓冲盐(6 mmol/L磷酸盐)的情况下，对生物阴极的长期运行进行了跟踪，以便对生物阴极在本系统运行参数下的稳定性有所认识。
从接种启动开始计时，对生物阴极的催化活性进行275 d的跟踪，结果(图 5、图 6)表明：0.8 V时生物阴极的最大电流密度在第153天与第62天时基本持平，其催化活性没有下降的趋势; 在第275天时进行的电压扫描表明，生物阴极的活性较第62天时出现了明显的下降。
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| 图 5 运行153 d的生物阴极分别在0.4 V(20 h)和0.8 V(4 h)下的电流密度跟踪 Figure 5 Current density with 153 d biocathodes under 0.4 V(for 20 hrs) and 0.8 V(for 4 hrs) |
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| 图 6 生物阴极在第62天和第275天的电压扫描图 Figure 6 Voltage scans with 62 d biocathodes and 275 d biocathodes in the SCMMEC |
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图 6a表明，历经275 d的运行，相对于62 d的生物阴极来说，2个生物阴极均表现出明显的催化活性下降。在图 6b中，运行62 d和275 d的生物阴极的电极电势相差不大。这与阴极电势的大小还受电流密度的影响有关。2个阴极在62 d时产生的电流密度明显大于275 d时产生的电流密度，从而使62 d与275 d时的阴极电势相差不大。
275 d的生物阴极微生物电解池因催化活性下降，停止运行。将2个生物阴极阴干，可在电极表面看到明显的白色盐沉积(图 7)。
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| a.新鲜石墨棒；b运行275 d后有盐沉积的生物阴极。 图 7 生物阴极运行275 d前后的照片 Figure 7 Photo of biocathodes before and after 275 d operation |
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运行过程中的pH值监测结果表明，溶液的pH值在6.9~7.2之间波动。鉴于系统运行的低电流密度和pH偏离中性不远，故生物阴极活性下降的主要原因应排除pH的偏离。长期单向通电极化使电极附近的pH偏离中性应是通电极化的一方面的表现；更重要的是其他大量离子的电迁移浓缩，即大量的阳离子向阴极迁移富集[18]。高浓度的阳离子可对产甲烷活性产生抑制作用[22-23]。生物膜上的盐沉积可以降低生物膜的活性、影响生物膜与外界的物质交换；因此，生物阴极活性下降的主要原因可能是极化导致的离子浓度升高，甚至超过相应盐的溶度积而发生盐沉积。同时，阴极的pH偏离中性应对盐沉积起到了助推作用。试验还发现晾干的阳极上也有盐沉积出现, 但其量明显较阴极少。众所周知，阳极氧化有机质使其生物膜偏酸化, 而酸化的环境并不利于盐沉积的发生。阳极上的盐沉积说明，即使是偏酸化的阳极，通电极化浓缩的盐离子也可超过其溶度积而析出沉淀。由此，不难理解对吸附浓缩的阳离子没有降解能力的阴极生物膜在偏碱性(阴极反应消耗H+)条件下更易先(较阳极)发生盐沉积而使活性下降。此外，本研究所用溶液是用自来水配制的，所加磷酸盐的浓度仅为6 mmol/L，非常接近废水的实际缓冲能力(4 mmol/L)[24]。低剂量磷酸盐下的长期运行仍有盐沉积发生，说明应尽可能避免电极的长期单向极化运行，否则会导致电极活性的下降而失败。最近，Zhen等[25]高压运行的产甲烷生物阴极也发现有盐沉积出现。
3 结论1) 在SCMMEC中，阴极上生长生物膜是不可避免的。相对于部分灭活和去膜参照，电压扫描表明以葡萄糖为碳源的SCMMEC中阴极上的生物膜具有一定的电活性。当外压为0.8 V时，2个阴极生物膜的电流密度可分别达到0.59 A/m2和0.62 A/m2，明显高于参照电极的0.40 A/m2和0.39 A/m2。利用SCMMEC获取生物阴极是一种实用的生物阴极获取方法。但生物阴极的活性仍然较低，是阴阳电极对中的电流限制电极。
2) 生物阴极运行60 d后的批式运行跟踪表明，该生物阴极的电子传递与溶液中可能的氧化还原介体和浮游生物无关。
3) 在外加低剂量缓冲盐(6 mmol/L磷酸盐)的情况下，0.8 V时生物阴极在第62天和153天时的活性持平，但在第275天时的测试显示生物阴极的活性已明显下降。阴干的生物阴极上析出了白色的盐沉积。直流电压下电极的长期单向极化不可避免地会导致离子浓缩，甚至盐沉积，这可能是影响生物阴极活性下降的主要原因。阴极的pH值偏离中性应对生物阴极的活性下降和盐沉积起到了助推作用。
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