克罗诺杆菌（Cronobacter spp.，原阪崎肠杆菌），年被鉴定命名为阪崎肠杆菌（Enterbacter sakazakii），2008年，Iversen等^[1]将阪崎肠杆菌划分为一个独立的新属——克罗诺杆菌属，2012年Joseph等^[2]根据多序列比对分析将克罗诺杆菌属分成7个种。克罗诺杆菌为革兰阴性无芽孢杆菌，其感染新生儿使其患脑膜炎、菌血症、坏死性小肠结肠炎等疾病^[2]，并带来严重的神经系统后遗症，有较高的死亡率。在1961年Urmenyi和Franklin首次报道了阪崎肠杆菌的感染，随后此菌受到了广泛的关注^[2-3]。近期研究表明，克罗诺杆菌是一种广泛存在的微生物，到目前为止已从奶酪、猪肉、蔬菜、谷类、草药、香辛料和经过UHT灭菌的牛奶等食品中分离出克罗诺杆菌。克罗诺杆菌对新生儿具有更为严重的危害性，严重威胁到公共卫生安全和人类健康^[4]。在“种”水平上快速、准确的鉴定是克罗诺杆菌研究的基础，对进一步认识和了解克罗诺杆菌具有重要意义^[5]。传统的分种方法利用细菌的生理生化特征对克罗诺杆菌进行分种，近年来分子生物学技术被广泛应用于细菌的分种工作，可以弥补传统生化方法操作繁琐，区分度差，稳定性低等不足。本研究对国内外报道的多种用于克罗诺杆菌分种的方法的优缺点进行了比较。

最新分类表明克罗诺杆菌属共分为7个种，包括C. sakazakii、C. malonaticus、C. turicensis、C. muytjensii、C. dublinensis、C. condiment、C. universalis^[6]。不同种的克罗诺杆菌具有不同的生物学特性和毒力特征，不同菌株间也具有不同的定植、黏附和侵入能力^[7-8]。据多位点序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）数据库统计（http://pubmlst.org/cronobacter），目前分离到的克罗诺杆菌属菌株中各个种所占的比例：C. sakazakii（66.43%），C. malonaticus（11.60%），C. turicensis（3.99%），C. muytjensii（2.81%），C. dublinensis（8.18%），C. condiment（0.15%），C. universalis（0.82%），other（5.98%）^[9]。C. sakazakii可以分解腐胺、松二糖、麦芽糖酸、乳果糖、顺乌头酸，对肌醇的利用是可变的，只有极少数菌株可以分解丙二酸盐；C. malonaticus可以分解丙二酸盐、乳果糖、麦芽糖酸、松二糖，对腐胺和肌醇的利用是可变的；C. turicensis可以分解松三糖、半乳糖醇、肌醇、松二糖、顺乌头酸、腐胺、乳果糖和丙二酸盐等；C. muytjensii可以合成吲哚并分解半乳糖醇、肌醇、腐胺、乳果糖，它对松二糖、乌头酸、异麦芽酮糖的利用是可变的；C. dublinensis可以分解乌头酸、异麦芽酮糖和4-氨基丁酸，它合成吲哚和分解松二糖、丙二酸盐、肌醇、腐胺和乳果糖的能力是可变的；C. condiment可以合成过氧化氢酶、α -葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶和脱氧核糖核酸酶，但是不能合成氧化酶；C. universalis同样可以合成过氧化氢酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶和脱氧核糖核酸酶，但是不能合成氧化酶。

这7个种的细菌都能使人致病，但是临床分离的致病菌株多数主要为C. sakazakii和C. malonaticus，也有部分的病例由C. turicensis和C. universalis感染引起^[10-11]。研究证实引起新生儿脑膜脑炎的C. sakazakii主要为第4基因型（sequence type 4，ST4），提示ST4的C. sakazakii可能具有比其他型别更强的致病性^[12-13]。

有研究表明，临床分离到的C. sakazakii和C. malonaticus有不同于克罗诺属其他“种”的特殊的三价铁离子转运系统（fec system）^[14]。进化分析结果表明编码这个三价铁离子转运系统的基因与人类致病菌致病基因有很高的同源性，表明这个铁离子运输系统在C. sakazakii和C. malonaticus导致人体致病的过程中发挥着重要作用，而C. dublinensis和C. muytjensii编码的是与植物性病原菌具有的铁载体相结合的受体，因此可能与植物病原菌关系更为密切。C. sakazakii是克罗诺杆菌属中唯一可以利用唾液酸作为碳源的菌种，而编码与唾液酸利用过程有关的酶和转运蛋白的nanAKT基因簇也是C. sakazakii所特有的^[15]。目前已知在母乳、婴幼儿配方奶粉和脑神经节苷脂中都含有唾液酸成分。

生化方法是早期对克罗诺杆菌不同种的常规鉴定方法，主要是依据克罗诺杆菌不同的生理生化反应结果来进行。2007年，Iversen等^[1]对各个种的生化特点进行分析，发现通过观察Ind（吲哚）、Dul（卫矛醇）、AMG（α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷）产酸，以及Malo（丙二酸盐）合成试验这4个生化反应的实验结果可以大致将克罗诺杆菌鉴定到种的水平，但是C. turicensis和C. genomospecies 1（C. universalis）生化结果一致，无法将该2个种分开^{[5, 16]}。2008年，Iversen等^[1]通过14种生化反应将C. sakazakii、C. malonaticus、C. turicensis、C. muytjensii、C. dublinensis、C. genomospecies 1（C. universalis）这些种明确区分。但通过生化反应鉴定种的方法操作繁琐、耗时长、不易分辨结果，并且存在一定假阳性，所以并没有被广泛应用。

多数细菌可以通过16S rRNA序列的分析进行分种研究，即先用通用引物对菌株16S rRNA基因片段进行扩增并测序，将获得的序列通过MEGA 5.0软件构建系统发育树，由菌株聚类情况来判断结果。虽然这种方法能将菌株的其他“种”分开，但是无法将C. sakazakii和C. malonaticus严格区分^[16]。所以该方法不可以一次性地将克罗诺杆菌的所有的“种”区分，还需要与其他方法结合才能实现。

MLST分型是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，多用于细菌分型，而Joseph等^[2]则用该方法对克罗诺杆菌进行了分种研究。其对克罗诺杆菌7个管家基因atpD、pps、gltB、glnS、gyrB、infB、fusA进行扩增并测序，然后将测序结果与参考基因序列比对，选取有效序列片段，将所有的序列片段串联后做聚类分析，发现可以将克罗诺杆菌的各个种有效区分开^[2]。此方法在研究菌株多态性和菌株间亲缘关系上较有优势，但需要对7个管家基因进行测序，操作繁琐、成本较高。另外，报道中指出fusA基因序列在克罗诺杆菌不同种之间相对保守，且具有特异性，因此建议fusA基因用于克罗诺杆菌不同种的鉴定。此后有很多研究中沿用了该方法^{[2, 17]}。这种方法鉴定结果相对可靠，但缺乏直观性。

Kuhnert等^[18]在前人研究的基础上选择了克罗诺杆菌属菌株recN、rpoA、thdF这3个基因用MLSA的方法将克罗诺杆菌分离株鉴定到“种”水平。该方法通过选取recN、rpoA、thdF这3个基因的保守片段设计引物，然后进行扩增并测序，利用ClustalX 1.81软件和Bionumerics 5.1软件处理实验结果并进行系统发育分析，把克罗诺杆菌鉴定到种的水平。这种方法需要对3个基因进行分析比较，而且分析过程比较繁琐，需要进一步改进。

MALDI-TOF可以将待鉴定细菌培养物直接点在靶板上，通过检测微生物的特征性生物标识物（主要集中在2~20 kD），受生长环境和状态影响很小的持续高表达蛋白，获得质谱数据，与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较。通过对克罗诺杆菌全细菌蛋白的质谱数据分析，质量图谱中约在5 740（m/z）离子质荷比处出现的离子峰反映出了克罗诺杆菌属细菌的特征性，按照质谱数据的聚类分析结果可以将克罗诺杆菌鉴定到种的水平。Stephan等^[19]利用这种方法实现了克罗诺杆菌属菌株所有“种”的鉴定。但是在现阶段这种方法还存在一定的局限性，比如微生物蛋白指纹图谱数据库不够完善，一些罕见的菌种和新型菌种的图谱尚未被数据库收录，从而导致鉴定困难，还有一些含有混合菌种的血培养样本也难以鉴定。

2009年，Stoop等^[20]利用普通PCR方法进行了克罗诺杆菌属内6个种的区分和鉴定，该方法选用rpoB基因作为目标基因，参照克罗诺杆菌6个种的rpoB基因的序列分别设计了6对引物，扩增目的片段，根据不同种的菌株扩增的目的片段的长度可以大致将克罗诺杆菌在种的水平区分开，然而由于C. sakazakii和C. malonaticus的rpoB基因具有高同源性，因此还需要再设计一对引物才能将两者区别开。2013年，Huang等^[21]利用gyrB基因设计引物，建立了一种只能用于区别C. sakazakii和C. dublinensis的普通PCR检测方法。但是这种方法只能将这两个种鉴别，还要与其他的方法相结合才能将克罗诺杆菌的所有种鉴别出来。

荧光定量PCR技术因为其准确、快速、灵敏的特点被广泛应用于病原菌检测。2013年，Cai等^[22]以克罗诺杆菌的ompA基因为靶基因设计引物进行荧光定量PCR反应，并在荧光定量PCR反应结束后对PCR产物进行高分辨率溶解曲线的生成，根据溶解曲线的差异将克罗诺杆菌属内不同“种”的菌株区别开来。但是这种方法对设备和仪器的要求高，目前不能被广泛应用。

Li等^[9]通过结合16S rRNA和fusA基因的特异性建立了一种双重荧光定量PCR方法用于克罗诺杆菌的分种。将合成的两套探针和引物放在一个体系中进行双重荧光定量PCR反应即可以将C. sakazakii和C. malonaticus鉴定。在本研究中建立的双重荧光定量PCR体系，除了可以在短时间内将克罗诺属的C. sakazakii和C. malonaticus鉴别出来，还可以将C. turicensis鉴别出来，而且特异型好、灵敏度高。但此方法无法将所有的种进行一次性鉴定，还需要进一步的优化。

以上对克罗诺杆菌分种的各种方法进行了详细的介绍，现通过表格的形式对各种方法的优缺点进行了简明直观的展示（表 1）。

克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉的一种危害较大的食源性致病菌，不同的“种”对化学物质敏感性以及温度存在较大的差异，致病性强弱也可能有不同。传统的生化分种方法费时费力，近年来发展起来的分子生物学方法显示出了准确快速的优点，被广泛用于克罗诺杆菌的分种。随着克罗诺杆菌越来越多不同种菌株的基因组数据被公布，利用基因组信息找到克罗诺杆菌不同种特有的基因序列，并针对不同种或其产物开发新的检测靶标，建立特异性更强灵敏度更高的检测方法将是今后克罗诺杆菌分种研究发展的主要方向。

作者贡献:

李小芳 ORCID：0000-0002-0932-3792

李小芳：设计实验思路，查阅资料，收集数据并撰写文章

崔晶花：提供课题经费，指导文章的思路，并参与文章的修改