副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性的革兰阴性菌，广泛存在于水体、水底沉积物和水生动物体内。副溶血弧菌感染者可出现腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，严重者可出现败血症^[1]。副溶血弧菌污染是食用水产品引起食物中毒的主要原因，大部分病例发生于8－10月。副溶血弧菌感染暴发在全球很多国家和地区常有报道，如美国、法国、新西兰等，也是亚洲一些国家和地区细菌性食源性疾病的首要致病菌^[2-4]。

在中国，自1998年以来，报告的副溶血弧菌感染引起的食源性疾病暴发数量呈逐年增高的趋势，副溶血弧菌逐渐成为中国食源性疾病的主要致病菌^[5]。同时，副溶血弧菌在水产品中的检出率也呈增高趋势，并逐渐打破地域界限，由沿海地区向内陆地区播散。

由于抗生素在水产养殖业、畜牧业和临床治疗中的不规范使用，细菌耐药问题日益严重，多重耐药菌株的出现使得常规抗生素失去疗效，给临床治疗带来巨大挑战。据估计，美国每年耐药菌感染病例超过200万例，死亡约2.30万例^[6]。事实上，除了部分严重的病例外，大部分副溶血弧菌感染是自限性的，不需要应用抗生素。

本文主要综述了副溶血弧菌的耐药现状、耐药机制及相关检测方法，以期为副溶血弧菌耐药性相关研究的深入开展提供参考资料，促进抗生素在水产养殖业、畜牧业以及临床治疗中的合理使用。

1 副溶血弧菌的耐药现状

美国自1978年起就发现副溶血弧菌对氨苄西林有很高的耐药率^[7]。目前，许多国家和地区分离的副溶血弧菌都普遍对氨苄西林耐药。在环境和食品分离株中多耐药现象很普遍，这些菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等多种抗生素均有不同程度耐药，但在临床分离株中多耐药现象并不严重。

1.1 环境和食品分离株的耐药现状

从全球范围看，不同地区环境和食品分离的副溶血弧菌耐药谱存在差异，这与不同地区水产养殖环境和养殖模式等方面的原因相关。此外有研究发现，从水底沉积物分离的菌株抗生素耐药率明显高于从潮水和洪水中分离菌株的耐药率^[8]。在大西洋海岸，美国马里兰州沿海海湾分离的副溶血弧菌，对青霉素类抗生素的耐药率很高，其中青霉素耐药率68.00%，氨苄西林53.00%，对链霉素的耐药率较低，为4.00%，有96.00%的分离株对氯霉素中度耐药^[9]。大西洋东海岸的南非东开普省也有药敏数据显示，副溶血弧菌分离株对氨苄西林均耐药，同时对治疗弧菌常用抗生素如链霉素、四环素、卡那霉素等也有不同程度的耐药^[10]。

全世界的水产养殖业主要集中在发展中国家，尤其是亚洲地区。亚洲地区水产品中分离到的副溶血弧菌也经常有多耐药的报道：印度西南部虾养殖场中分离到的120株副溶血弧菌均为多耐药菌株，对常见的β-内酰胺类(氨苄西林)、磺胺类(磺胺甲恶唑)、喹诺酮类(恩诺沙星)药物有不同程度的耐药^[11]。Letchumanan等^[12-13]发现马来西亚的市售贝类和虾类分离的副溶血弧菌大部分为多耐药菌株，对治疗弧菌感染常用的二线和三线药物均耐药，其中对氨苄西林的耐药率最高，为80.00%以上，其次为阿米卡星、卡那霉素等氨基糖苷类抗生素，对三代头孢菌素也有一定程度的耐药。另有研究发现不同水产品分离到的副溶血弧菌耐药状况也不同，香蕉虾中分离的副溶血弧菌多耐药指数明显高于红虾；斑节对虾中分离的副溶血弧菌耐药率明显高于白虾、凡纳滨对虾、罗氏沼虾等其他种属的虾^[14]。

在中国，上海市售虾对氨苄西林的耐药率高达99.00%，其次为链霉素(45.30%)、利福平(38.30%)、壮观霉素(25.50%)，所有菌株均对四环素和氯霉素敏感^[14]。华北地区市售水产品中分离到的副溶血弧菌对链霉素的耐药率最高，为86.20%，其次为氨苄西林(49.60%)、头孢唑林(43.50%)、头孢噻吩(35.90%)，对阿奇霉素和氯霉素均敏感；其中从鱼样本中分离到1株副溶血弧菌对7种抗生素(链霉素、头孢噻吩、头孢唑林、氨苄西林、卡那霉素、复方磺胺甲恶唑、四环素)耐药^[15]。除了水产品之外，副溶血弧菌在其他肉食(鸡肉、牛肉、猪肉)的检出率也很高^[16]。中国地区市售即食食品中分离到对5种抗生素耐药的多耐药菌株均来自熟肉食品，分离到的副溶血弧菌耐药谱显示：对链霉素耐药率最高，为89.70%，其次是氨苄西林(51.30%)、头孢唑啉(51.30%)、头孢噻吩(41.00%)和卡那霉素(41.00%)；未发现对阿奇霉素、氯霉素、环丙沙星、萘啶酸、四环素耐药的菌株^[17]。

1.2 临床分离株的耐药现状

Pazhani等^[18]对印度15家医院的腹泻患者进行了为期12年的监测，分离到178株副溶血弧菌药敏结果显示：氨苄西林的耐药率最高，为98.00%；其次是链霉素为86.00%。有1株非大流行菌株对复方磺胺甲恶唑、萘啶酸、四环素、氯霉素、氨苄西林、链霉素等多种抗生素耐药；另有3株菌对11种抗生素均敏感。2009－2013年，从中国东南部8家医院门诊急性腹泻患者的粪便样本中分离到的501株副溶血弧菌进行药敏试验，氨苄西林的耐药率最高，为87.10%，其次是头孢西丁(56.90%)和头孢唑林(43.70%)；95.00%以上的菌株对其他9种常用抗生素敏感^[19]。

目前，有一些研究对副溶血弧菌临床分离株、环境分离株、食品分离株的耐药情况进行了比较研究。Tai等^[20]在越南南部多个城市收集433份急性腹泻患者粪便样本、233份水样、85份食品样本，共分离到130株副溶血弧菌，分离率分别为8.30%、20.10%和40.00%。药敏结果显示氨苄西林耐药率为45.40%，大部分副溶血弧菌对四环素(90.80%)、氯霉素(97.70%)、环丙沙星(100.00%)敏感。Ottaviani等^[21]对意大利地中海的贝类样本和临床样本中分离的副溶血弧菌进行药敏实验，研究发现96.30%的菌株为多耐药，不同来源的菌株多耐药指数没有明显差别；分析发现，临床菌株对环丙沙星的耐药率远高于环境菌株，其他药物的耐药率没有明显差别，见表 1。

有研究对中国副溶血弧菌流行株进行系统综述，共筛出290株临床和环境株。发现目前中国的大流行株在耐药谱方面无明显差异，对氨苄西林的耐药率较高，对头孢唑林、头孢呋辛等头孢菌素和阿米卡星等氨基糖苷类抗生素中度耐药，对其他大部分常用抗生素如美罗培南、四环素、左氧氟沙星等比较敏感，其中未发现多耐药菌株^[22]。

2 副溶血弧菌耐药机制 2.1 固有耐药

固有耐药指细菌对某些抗生素的天然不敏感，主要由染色体基因介导，一般比较稳定。固有耐药的产生主要包括两个方面，一是细菌缺乏对特定抗生素的易感靶位；二是细胞膜结构不同，导致副溶血弧菌能天然抑制万古霉素等糖肽类抗生素进入细胞^[23]。

2.2 获得耐药

获得耐药是细菌耐药性产生和扩散的主要原因。获得耐药指细菌在抗生素作用下产生了自身突变，耐药基因通过接合、转导、转换等方式水平转移，使细菌捕获或缺失某些遗传信息从而产生耐药性。耐药基因的转移和传播主要由质粒、转座子、整合子等可移动遗传元件介导^[24-25]。

副溶血弧菌获得耐药产生的生化机制主要概括为：①通过增加药物排出或减少药物渗入，减少抗生素到达靶细胞；②通过基因突变或修饰，改变与抗生素结合的靶位，使抗生素不能发挥作用；③通过产生耐药酶，水解、转移或灭活抗生素^[23]。

2.2.1 减少抗生素到达靶细胞 2.2.1.1 细胞膜的通透性

细菌的细胞膜是阻碍抗生素进入细胞的天然屏障。革兰阴性菌的肽聚糖结构通透性较差，因此副溶血弧菌等革兰阴性菌对万古霉素等抗生素天然不敏感。

2.2.1.2 外排泵作用

外排泵是一类膜转运蛋白，能将抗生素等物质有选择性地或无选择性地排出到细胞外。主要的药物外排泵系统包括四类：主要协助蛋白转运超家族(MFS)、小多耐药蛋白超家族(SMR)、耐药结节分化超家族(RND)、ATP结合盒超家族(ABC)^[26]。所有细菌都携带编码多药外排泵的基因^[23]，有的位于质粒上，可以在细菌之间转移。多药外排泵在细菌多重耐药性方面发挥了重要作用，是细菌产生多重耐药性的主要机制^[27]。

从现有的基因组序列获得的数据估计，副溶血弧菌中含有约50种多药外排泵，其中最主要的是NorM蛋白，这是一种诺氟沙星外排蛋白，含有许多疏水残基和12个跨膜区域^[28]，属于多药和毒性化合物外排转运蛋白家族(Multi Antimicrobial Extrusion，MATE)这一新型家族成员，MATE家族可以保护细菌不与药物及其他毒物结合。研究发现，副溶血弧菌的NorM蛋白是一种Na⁺驱动的反向转运的多药外排泵，该蛋白跨膜区域上的酸性氨基酸残基Asp32、Glu251和Asp367参与药物外排的过程，介导了副溶血弧菌对诺氟沙星和卡那霉素的耐药^[29]。

2.2.1.3 生物膜系统

生物膜是细菌附着在固体表面生长，并形成由菌体及其分泌的基质包裹在一起的膜状复合物。生物膜形成后，细菌对环境的适应性、耐药性及抵抗宿主免疫细胞的吞噬作用明显增强。细菌生物膜耐药机制并未完全阐明。大部分观点认为：一方面，细菌形成的生物膜可以构成一个外部屏障，限制或减缓抗生素的渗入^[30]；另一方面，细菌在生物膜状态下，Ⅰ类整合酶基因表达上调^[31]，突变率提高，这种相互接触更为紧密的环境导致菌体间质粒的接合、转导等频率也随之增高，这为菌体间耐药基因的扩散提供了有利条件。

致病性副溶血弧菌能形成生物膜，从而与载体进行特异性的结合。生物膜的形成与菌浓度、温度、NaCl浓度、pH值等因素密切相关，Ca²⁺能促进副溶血弧菌形成生物膜。有研究发现，耐药较高的弧菌形成生物膜的能力也相对较强^[32]，但关于副溶血弧菌生物膜与耐药性之间的关系还有待进一步研究。

2.2.2 靶位基因突变

细菌与抗生素结合的靶位基因突变，导致抗生素不能产生作用，这是细菌产生耐药性的重要原因。目前对该机制研究最多的是喹诺酮类药物的靶位基因突变。细菌对喹诺酮类药物的耐药主要是由于编码DNA旋转酶或拓扑异构酶Ⅳ的基因突变所致^[33]。DNA旋转酶由GyrA和GyrB亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码，拓扑异构酶Ⅳ由ParC和ParE亚基组成，分别由parC和parE基因编码。细菌对喹诺酮类药物的耐药主要与gyrA和parC基因突变有关^[34]。大部分喹诺酮类耐药突变发生于gyrA基因序列上67~106位氨基酸残基之间，称为喹诺酮耐药决定区(Quinolone Resistance-Determining Region，QRDR)^[35]。

研究表明，大部分对环丙沙星等喹诺酮类药物耐药的副溶血弧菌，其gyrA基因83位氨基酸由丝氨酸突变为异亮氨酸；对于耐药水平高的菌株，其parC基因也会发生点突变，第85位氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸^[36]。

2.2.3 耐药酶

细菌可以通过产生钝化酶或灭活酶来破坏或灭活抗生素的活性。细菌产生的耐药酶主要有β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和大环内酯类-林克霉素类-链阳菌素类钝化酶。

现有研究发现，副溶血弧菌对β-内酰胺类(氨苄西林、头孢菌素)、氨基糖苷类(卡那霉素)及氯霉素类(氯霉素)抗生素的耐药主要通过β-内酰胺酶、氨基糖苷磷酸转移酶及氯霉素乙酰转移酶等耐药酶类介导^[37]。目前对副溶血弧菌该机制研究最多的是其产生的β-内酰胺酶。β-内酰胺酶能够特异性地打开分子结构中的β-内酰胺环，使β-内酰胺类抗生素失去抗菌活性。研究表明，在副溶血弧菌中存在组氨酸激酶/应答调节蛋白——VbrK/VbrR，可以控制β-内酰胺酶的表达，介导副溶血弧菌对β-内酰胺类抗生素的耐药^[38]。Li等^[16]发现携带有编码β-内酰胺酶基因(bla_TEM-1、bla_PER-1、bla_CMY-2、bla_VEB-2等)的可结合质粒介导了副溶血弧菌对广谱头孢菌素的耐药。

3 副溶血弧菌耐药性检测 3.1 耐药表型检测

细菌耐药表型检测的常规方法为药敏试验，主要包括纸片扩散法、肉汤稀释法、浓度梯度法和自动化检测系统^[39]。药敏结果的判定是依据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)弧菌属的标准M45^[40]。纸片扩散法不需要特殊的仪器，具有抗生素选择灵活、成本较低等优点，是副溶血弧菌药敏试验中最常采用的一种方法，由于副溶血弧菌是嗜盐菌，因此进行药敏试验的比浊液中应添加适量的NaCl，一般为0.85%。肉汤稀释法能够获得最小抑菌浓度(Minimal Inhibition Concentration，MIC)，商品化的药敏板具有操作方便、可重复性强的优点。浓度梯度法是通过抗生素在琼脂板上扩散成浓度梯度来定量测量抗生素敏感性，商品化的方法为E- test法，操作方便，可作为副溶血弧菌耐药模糊结果的确认。临床常用于检测副溶血弧菌的自动化仪器系统主要为Vitek系统和BD Phoenix系统，可以全自动地对耐药结果进行定性和定量的分析，具有简便、快速的优点。

3.2 耐药基因检测

在药敏试验的基础上，如果能知道细菌是否携带有耐药基因，能更好地预测药物治疗的效果，解释耐药机制。常用的细菌耐药基因检测的方法包括PCR法、DNA探针法、基因芯片技术、飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)、全基因组测序等^[41]。这些检测方法具有快速、简便、灵敏度和特异度高等特点，同时可以结合基因克隆和测序来分析耐药基因的结构及突变情况。

目前，在副溶血弧菌中已经检测到多种耐药基因，主要包括β-内酰胺类耐药基因bla_TEM、bla_CMY、bla_PER；氯霉素类耐药基因catA、catB；氨基糖苷类耐药基因aphA；四环素类耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetG、tetM、tetS等^{[16, 42]}。抗生素耐药基因数据库(Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB)公布的副溶血弧菌耐药基因主要有两类：一类是编码MATE家族的多药物外排泵基因，介导环丙沙星、卡那霉素、诺氟沙星、链霉素等药物的耐药；另一类是编码黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因，介导四环素的耐药，其机制尚不清楚。

细菌耐药基因与耐药表型之间存在一定的相关性，大多数情况下，细菌携带某种耐药基因可以表现出相应的耐药表型。但有些情况下副溶血弧菌中虽检出了某种耐药基因，但是却对相应的抗生素敏感^[43]；而有些情况下发现副溶血弧菌对某些抗生素耐药却未能检测到相应的耐药基因^[13]。造成这种不一致的原因比较复杂，值得进一步深入研究。

4 小结

传统的副溶血弧菌对大部分抗生素是敏感的，但近些年研究发现，许多国家和地区分离的副溶血弧菌都观察到多耐药现象。质粒等可移动遗传元件介导的耐药基因的传播及扩散，加速了副溶血弧菌多耐药菌株的出现，从而增加了抗生素治疗失败的可能性。因此，应充分利用已有的知识、技术、数据库，进一步推动副溶血弧菌的耐药机制研究。同时推广替代性的治疗方法如益生菌治疗或噬菌体治疗可以降低抗生素的使用、减缓耐药菌的出现^[44]，通过现有的监测网络发现新型耐药菌，并对其危害进行迅速评估，研发新一代抗生素也十分必要。

作者贡献:

陈美玲  ORCID：0000-0002-7244-1724

陈美玲：论文撰写

逄波：论文指导