鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究
  疾病监测  2018, Vol. 33 Issue (4): 294-299

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徐帅, 侯雪新, 孙丽娜, 张景山, 吉兴照, 唐璐, 韦超, 李和桥, 王雪冰, 李振军
Xu Shuai, Hou Xuexin, Sun Lina, Zhang Jingshan, Ji Xingzhao, Tang Lu, Wei Chao, Li Heqiao, Wang Xuebing, Li Zhenjun
鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究
Immunoproteomics research of cellular protein of Nocardia farcinica
疾病监测, 2018, 33(4): 294-299
Disease Surveillance, 2018, 33(4): 294-299
10.3784/j.issn.1003-9961.2018.04.009

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收稿日期:2017-12-26
鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究
徐帅, 侯雪新, 孙丽娜, 张景山, 吉兴照, 唐璐, 韦超, 李和桥, 王雪冰, 李振军     
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
摘要目的 通过鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有免疫原性的蛋白,为筛选鼻疽诺卡菌特异诊断抗原提供线索。方法 提取鼻疽诺卡菌菌体蛋白进行双向电泳,结合免疫印迹法筛选与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生免疫反应的蛋白点。结果 在鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫杂交膜上,共发现9个具有抗原活性的蛋白,其中8个可在考马斯蓝染色胶上找到匹配点,通过介质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成功鉴定8个蛋白,全部定位于胞内。结论 本研究成功建立鼻疽诺卡菌免疫蛋白质组学方法,在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现新的具有免疫原性的蛋白,可作为鼻疽诺卡菌特异性诊断候选抗原,用于诊断试剂的研究。
关键词鼻疽诺卡菌    菌体蛋白    免疫蛋白质组学    
Immunoproteomics research of cellular protein of Nocardia farcinica
Xu Shuai, Hou Xuexin, Sun Lina, Zhang Jingshan, Ji Xingzhao, Tang Lu, Wei Chao, Li Heqiao, Wang Xuebing, Li Zhenjun     
State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
This study was supported by the fund for National Priority Research and Development Program of China(No. 2017YFC1200303,2016YFC1200701)
Corresponding author: Li Zhenjun, Email:lizhenjun@icdc.cn.
Abstract: Objective To identify the immunogenic proteins in Nocardia farcinica cellular proteins and provide evidence for the screening of specific diagnostic antigens for N. farcinica. Methods The cellular proteins of N. farcinica IFM 10152 were extracted to perform two-dimensional polyacrylamide electrophoresis and western blot assay to screen immunogenic proteins which can react with N. farcinica infected rabbit sera. Results Through immunoblotting of the cellular proteins of N. farcinica, 9 proteins with antigenicity were found, in which 8 proteins had matching spots on 2-DE gel. After in-gel digestion, 8 immunogenic proteins were identified by MALDI-TOF MS, which were all in cytoplasm. Conclusion A immunoproteomics assay was established in this study by which novel immunogenic proteins were found in N. farcinica cellular proteins. This assay can be used in the screening of specific diagnostic antigens for N. farcinica in the research of diagnostic reagent of N. farcinica.
Key words: Nocardia farcinica     Cellular proteins     Immunoptotemics    

诺卡菌(Nocardia)至少包括50个种,其中约50%对人或动物有致病性[1]。诺卡菌病的临床症状和微生物学特征随诺卡菌种的不同而变化[2]。其临床表现包括肺部感染、皮肤感染和散播性感染,常见于免疫缺陷患者,但任何宿主均有可能患病[3-4]。其中以鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)致病性最强,在临床样品中分离率最高,较其他菌更易侵袭正常宿主[5-9]。其主要引起肺部感染和散播性感染[10-12],几乎可影响到身体的每个器官,如皮肤、肺,甚至入侵至脑,引起脑脓肿[5]。鼻疽诺卡菌引起的脑脓肿病例有限,但有上升趋势。Kumar等[13]通过文献检索回顾1966-2011年报道的诺卡菌病病例个案报告,其中因鼻疽诺卡菌引发41例脑脓肿病例。近年来,又新增4例[14-17]

诺卡菌病的诊断主要依靠传统的分离培养和核酸检测[18],通常需较长时间而耽误治疗。同时,诺卡菌病的临床症状通常并不特异,一些症状与结核病相似,很难被鉴别。若诺卡菌感染患者诊断不及时,很难得到及时、针对性的治疗,导致感染慢性化和合并各种并发症,使疾病负担重、预后差[19]。因此,筛选诺卡菌中保守性较强、具有抗原性的蛋白作为诊断靶标有重要意义。本研究采用免疫蛋白质组学方法鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有抗原活性的蛋白,为筛选诺卡菌病诊断靶标奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和菌株

2月龄健康雄性新西兰大白兔购于北京维通利华实验动物技术有限公司;鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152购于德国微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂

脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基,购于OXOID公司。IPG干胶条(ReadyStripTM IPG Strip,17 cm,pH值4~7)、IPG缓冲液(pH值4~7)和矿物油购于Bio-Rad;尿素、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、溴酚蓝、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖、考马斯亮蓝G250、硫酸铵、三氯乙酸(TCA)等购于Sigma公司。2D定量试剂盒(2D Quant Kit)、2D去除杂质试剂盒(2D Clean-Up Kit)和杂交纸(blotting paper)购于Amersham公司。核酸酶、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜购于Millipor公司。

1.2 方法 1.2.1 鼻疽诺卡菌多抗血清制备

将鼻疽诺卡菌单菌落接种于BHI液体培养基中,180 r/min,37 ℃,培养24 h。按1:100比例转接于BHI中,培养至对数生长期。5 411 × g离心10 min,去上清液。以0.1%甲醛溶液,置于37 ℃温箱,20 h灭活后,进行无活菌检测。离心,去上清液,PBS洗涤3次。用PBS调整菌液A值为0.8,菌液浓度约为108 /ml。健康雄性新西兰大白兔免疫前先于一侧耳缘取2 ml静脉血,2 862 × g离心,取血清作为阴性对照。另一侧耳静脉注射1 ml预先制备的菌液,加强免疫2次,间隔时间为2周。对照组注射同等体积的PBS。第3次免疫后14 d,心脏取血,2 862×g离心10 min,取血清,置-80 ℃保存备用。

1.2.2 菌体蛋白样品的制备

将鼻疽诺卡菌单菌落接种于BHI培养基中,180 r/min,37 ℃,过夜培养24 h。将摇过夜的菌液以1: 100转接于99 ml BHI培养基,37 ℃,培养至对数期。4 ℃,5 411× g离心10 min,收集菌体。用预冷的低盐磷酸缓冲盐溶液(PBS)(68 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、9 mmol/L Na2HPO4和1.5 mmol/L KH2PO4)洗3次后去除上清液。超声液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)和0.1%叠氮化钠,pH值7.4)重悬菌体,冷浴超声3次,每次5 min,脉冲3.5 s,停3 s,40%振幅。加入2.5 U/ml核酸酶,混匀后,室温作用15 min,转移至1.5 ml离心管中。40 000×g离心30 min,取上清液。加入10% TCA,冰浴3 h,13 000×g离心40 min。用预冷的丙酮洗3次。用裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS和1% DTT)重悬菌体蛋白。利用2D去除杂质试剂盒进行纯化后,使用2D蛋白定量试剂盒测浓度,以800 μg分装,置于-80 ℃保存备用。

1.2.3 双向电泳

按照BIO-RAD操作手册进行,800 μg蛋白样品与水化液(8 mol / L尿素、4% CHAPS、60 mmol / L DTT和0.001%溴酚蓝)和1% IPG缓冲液(pH值4~7)混合,总体系为300 μl。室温放置30~60 min,15 ℃,40 000×g离心1 h,取上清液。将蛋白样品缓慢加入聚焦盘,放下17 cm IPG胶条,使蛋白样品液均匀分布在胶条下,不要产生气泡。滴加1 ml矿物油,使之均匀覆盖在胶条上,室温吸涨2 h,30 V、10 h。第1向等点聚焦按照BIO- RAD操作手册进行,程序设置为300 V 1 h、600 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 1 h、8 000 V 10 h。聚焦结束后,进行第2向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将胶条放入平衡液Ⅰ(6 mol/L尿素、2% SDS、1.5 mol/L Tris-HCl pH值8.8、30%甘油、1% DTT和0.001%溴酚蓝)中,置于摇床上晃动15 min。在平衡液Ⅱ(6 mol/L尿素、2% SDS、1.5 mol/L Tris-HCl pH值8.8、30%甘油、2.5%碘乙酰胺和0.001%溴酚蓝)中平衡15 min,操作同上。平衡后的胶条使用12.5%的SDS-PAGE胶进行电泳,20 mA电泳20~40 min,然后以60 mA至电泳结束,约4 h。图像采用PowerLook 2100XL扫描仪(UMAX公司)进行扫描采集。

1.2.4 免疫杂交

采用半干转印法转移至PVDF膜上,丽春红染色10 min,水洗脱色并迅速用针头在膜上刺孔以定位蛋白,扫描后进行免疫印迹(Western Blot,WB)。PVDF膜浸没在200 ml封闭液(TBS、0.05 %吐温-20、5%脱脂奶粉)中,置于摇床缓慢摇动约1 h,然后放于4 ℃冰箱,封闭过夜,与封闭液稀释的抗鼻疽诺卡菌兔血清(1:500)室温孵育2 h,TBST洗3次,每次10 min;荧光标记的羊抗兔IgG二抗(1:10 000)避光室温孵育1 h,TBST洗3次,第1次和第2次均为30 min,第3次10 min,最后用TBS洗膜5 min,以去除吐温-20。采用Odyssey扫描仪(LICOR公司)进行扫描保存。每个样品重复3次,对3次均为阳性的蛋白点进行鉴定,取本底血清作为阴性对照,以剔去非特异性杂交点。

1.2.5 胶内酶切和质谱鉴定

将考马斯蓝染色胶与WB显色膜进行比对,确定胶上免疫反应蛋白点。从考马斯蓝染色胶上切取相应蛋白点进行脱色后,使10 mmol/L DTT和55 mmol/L碘乙酰胺先后对胶块进行还原和烷基化。冷冻干燥约1 h后,加入40 g/ml的胰蛋白酶2 μ(l胰蛋白酶溶于pH值8.0,25 mmol/L NH4HCO3),待胶块完全涨大后,置于4 ℃冰箱30 min,加入10 μl 25 mmol/L NH4HCO3,37 ℃水浴16 h。离心后,将反应液吸出。向胶块加入10 μl的5%TCA,37 ℃放置1 h。将液体吸入干净的离心管中。向胶块加入10 μl的2.5% TCA-50%乙腈溶液,37 ℃放置1 h。将液体吸入到上述的离心管中,进行真空干燥。使用4700 MALDI TOF / TOF Proteomics Analyzer(美国ABI公司)进行质谱鉴定,同时在鼻疽诺卡菌IFM 10152基因组本地运行数据库中进行Mascot在线检索。Mascot可支持几乎所有常用的质谱输出数据,可实现从质谱数据到蛋白质的鉴定。鉴定的蛋白序列使用在线软件Web Gene Ontology(http://wego.genomics.org.cn/[20]进行蛋白功能预测;使用在线软件pSORTb(version 3.0.3,www.psort.org/psortb/index.html[21]进行蛋白定位预测。

2 结果 2.1 菌体蛋白谱

首先以pH值3~10的IPG胶条进行2D电泳分析,经考马斯蓝染色、扫描和分析发现,鼻疽诺卡菌菌株的菌体蛋白大多分布在pH值4~7范围内,故采用pH值4~7的胶条进行蛋白2D电泳分析,共检测到约蛋白点480个(图 1)。

图 1 鼻疽诺卡菌菌体蛋白2D电泳考马斯蓝染色 Figure 1 Identification of immunogenic proteins of N. farcinica by two-dimensional gel 注:1:假想的热休克蛋白;2:假想的磷酸丝氨酸转氨酶;3:假想的硫代硫酸硫基转移酶;5:假想的环化酶;6:假想的电子转移黄素蛋白β亚基;4、7、8:假想蛋白
2.2 菌体蛋白免疫杂交谱

取菌体蛋白进行并行双向电泳,一块胶进行考马斯蓝染色,用于图谱分析和蛋白点的鉴定,另一块胶的蛋白转移至PVDF膜上,与抗鼻疽诺卡菌兔血清进行WB。经显色后,杂交膜上共发现9个杂交点,共有8个点可与考马斯蓝染色胶上蛋白点匹配(图 2)。

图 2 鼻疽诺卡菌菌体蛋白与抗鼻疽诺卡菌兔多抗杂交 Figure 2 Identification of immunogenic proteins of N. farcinica by Western Blot 注:1:假想的热休克蛋白;2:假想的磷酸丝氨酸转氨酶;3:假想的硫代硫酸硫基转移酶;5:假想的环化酶;6:假想的电子转移黄素蛋白β亚基;4、7、8:假想蛋白
2.3 质谱鉴定及检索结果

切取蛋白点进行酶切和质谱鉴定,其中8个蛋白鉴定成功(表 1)。经蛋白定位预测,8个蛋白全部位于细胞质。

表 1 鼻疽诺卡菌菌体蛋白中抗原蛋白点质谱鉴定 Table 1 Cellular immunogenic proteins of N. farcinica identified by MS
蛋白序号 a 蛋白描述 b 蛋白ID号 编码基因 功能分类 d 蛋白定位 e 相对分子质量 f 等电点 分数 g 序列覆盖率(%)
1 假想热休克蛋白 BAD60261.1 NFA_54090 核苷结合, 细胞代谢加工 细胞质 65 720 4.75 964 24
2 假想的磷酸丝氨酸转氨酶 BAD55500.1 NFA_6550 转移酶活性, 细胞代谢加工 细胞质 40 144 4.9 286 25
3 假想的硫代硫酸硫基转移酶 BAD56698.1 NFA_5940 转移酶活性 细胞质 31 053 4.74 280 22
4 假想蛋白 c BAD59128.1 NFA_17740 生化过程调控,细胞壁合成蛋白 细胞质 30 363 5.04 577 40
5 假想的环化酶 BAD56620.1 NFA_18520 转移酶/裂解酶活性 细胞质 26 929 4.68 343 41
6 假想的电子转移黄素蛋白 β亚基 BAD60261.1 NFA_42790 电子载体活性 细胞质 27 466 4.76 207 22
7 假想蛋白 BAD55411.1 NFA_5660 水解酶活性 细胞质 23 136 5.31 267 32
8 假想蛋白 BAD56067.1 NFA_12220 水解酶活性/离子结合 细胞质 22 230 4.71 110 15
注:a蛋白序号与2D电泳和WB图一致(图 12); b鼻疽诺卡菌IFM 10152全基因组注释信息; c假想蛋白指目前全基因组注释信息中结构和功能均未知, 但切实存在的蛋白; d在线软件Web Gene Ontology预测蛋白功能分类(http://wego.genomics.org.cn/); e在线软件pSORTb (version 3.0.3, www.psort.org/psortb/index.html)预测蛋白定位; fMascot检索数据库预测蛋白质理论相对分子质量和等电点; g肽指纹图谱与数据库中所有蛋白指纹进行匹配的分数
3 讨论

免疫蛋白质组学是将蛋白质组学技术与传统WB手段相结合的交叉学科,将高通量、高分辨率的分离生物体全部蛋白与抗原抗体在体外特异性结合的优势相结合[22],为筛选免疫原性蛋白提供技术手段,有助于疾病诊断标志物和疫苗学的发展。

诺卡菌在环境中普遍存在,在世界范围内均有发现,尤其在热带、亚热带气候地区常有发生。因医务人员缺乏对诺卡菌的认识和研究,临床医生在肺部感染疾病诊断时很少考虑诺卡菌病感染,常被误诊为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染,而诺卡菌普遍对传统抗结核药耐药[23]。因误诊、漏诊造成感染诺卡菌的免疫缺陷患者病死率较高[24]。血清学诊断是诺卡菌引起感染一种快速简便的方法。因此,本研究采用免疫蛋白质组学技术,鉴定鼻疽诺卡菌免疫原性蛋白,为临床诊断提供实验基础。

通过Web Gene Ontology(WEGO)注释分析,对8个鉴定的蛋白进行蛋白功能预测。生物信息学分析结果表明,这些蛋白具有多样的生物学功能,包括核苷酸结合蛋白、细胞代谢加工、电子载体蛋白和离子络合。几种酶活性包括转移酶、裂解酶和水解酶活性。蛋白点1为假定的热休克蛋白,经BLAST检索发现,该蛋白具有DnaK功能,参与细菌毒力、解毒和宿主防御[25]。许多胞内菌利用囊膜向宿主细胞传递毒力因子,如毒素、黏附素和免疫调节物等[26]。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的囊膜皆存在DnaK [27],其可能在病原体感染中起重要致病作用,但缺乏特异性,难以作为检测抗原。蛋白点2、3和5具有转移酶活性。转移酶包括磷酸丝氨酸转氨酶、硫代硫酸硫基转移酶和咪唑甘油、磷酸合成酶环化酶亚基(HisF)。磷酸丝氨酸转氨酶参与丝氨酸的生物合成,该酶的下调可能影响包皮垢分枝杆菌(M. smegamatis)的渗透性和细菌的存活[28]。硫代硫酸硫基转移酶由供体底物先转移硫烷硫原子到酶活性中心,之后再转移到嗜硫受体。该酶的主要功能是向受体底物氰化物转移硫烷硫原子[29]。咪唑甘油三磷酸合成酶属于谷氨酰胺转移酶家族,由2个亚基组成,即HisH和HisF,HisH具有谷氨酰胺酶活性,而HisF催化环化酶反应,合成咪唑甘油三磷酸合成酶。HisF构象的改变影响底物结合、催化作用和/或HisF和HisH间信号的传递[30]。氨基酸序列分析表明,蛋白点2、蛋白点3和蛋白点5与结核分枝杆菌的磷酸丝氨酸转氨酶、硫代硫酸硫基转移酶和环化酶的相似度很高,分别为71.86%、83.45%和80.47%,作为临床诊断候选蛋白意义不大。蛋白点4和6分别为细胞壁合成蛋白和离子载体蛋白。有研究报道,胆固醇在结核分枝杆菌感染和隐性感染过程中的起重要作用[31]。当胆固醇作为唯一碳源时,结核分枝杆菌的细胞壁合成蛋白和离子载体蛋白过度表达,可能有利于休眠状态的结核分枝杆菌克服不利的细胞内环境[32]。在以往研究中没有报道蛋白点4具有抗原性,同时其在诺卡菌中具有保守性,可作为判定病原菌感染的标志性蛋白的候选抗原进一步研究。蛋白点7和8均为折叠类金属水解酶,具有水解酶活性。将蛋白序列在BLAST中进行检索发现,2个蛋白仅在诺卡菌属和红球菌属(Rhodococcus spp.)中具有保守性,在其他菌属中未发现相似性高的蛋白,因此,折叠金属水解酶为诺卡菌的特异蛋白,可能作为标志性蛋白用于特异诊断试剂的研究。

本研究因菌体蛋白数量繁杂,可能高丰度蛋白遮蔽一些低丰度蛋白,使WB膜上检测到的阳性点在考马斯蓝染色胶图上无法肉眼识别匹配的蛋白点,导致具有良好免疫原性的抗原被漏检。可采用抗体亲和层析方法去除高丰度蛋白[33]

本研究成功建立了免疫蛋白质组学技术平台。在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现8种蛋白可与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生杂交,具有抗原活性,但这些蛋白是否具有良好的免疫原性和特异性,需进一步研究证实。同时本研究采用健康兔免疫血清进行抗原筛选,而感染鼻疽诺卡菌的患病人群除正常宿主,还有相当一部分免疫缺陷病患者,故采用抗原进行检测时,临床血清样品的来源应包含非免疫缺陷和免疫缺陷患者,用以验证其灵敏度。

作者贡献:

徐帅  ORCID:0000-0002-8686-0268

徐帅:实验设计、实验操作、论文撰写

侯雪新、孙丽娜、张景山:文章审核

吉兴照、唐璐、韦超:文献检索

李和桥、王雪冰:论文修改完善

李振军:定题并给出指导性意见

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