利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌
  疾病监测  2018, Vol. 33 Issue (3): 246-250

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韩营营, 段瑶, 李杰, 闫梅英
Han Yingying, Duan Yao, Li Jie, Yan Meiying
利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌
Rapid detection of Salmonella Anatum in stool samples using PCR
疾病监测, 2018, 33(3): 246-250
Disease Surveillance, 2018, 33(3): 246-250
10.3784/j.issn.1003-9961.2018.03.018

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收稿日期:2017-11-27
利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌
韩营营, 段瑶, 李杰, 闫梅英     
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室, 北京 102206
摘要目的 建立应用PCR技术鉴定鸭沙门菌血清型的方法,并评价其特异度、灵敏度和检测下限。方法 从GenBank下载截至2015年8月的所有沙门菌基因组序列进行比对,得到鸭沙门菌血清型特异的基因序列,设计引物,建立普通PCR检测体系并验证引物的特异度和灵敏度。同时利用模拟粪便样本确定其检测下限。结果 利用鸭沙门菌特异基因AW58_15605建立的PCR检测方法,对全部鸭沙门菌纯菌及其临床样本的扩增结果均为阳性,而对鸭沙门菌血清型以外的沙门菌和肠道菌的扩增结果均为阴性,检测的特异度和灵敏度均为100%。以粪便模拟样本提取DNA为模板进行检测,增菌后该方法检测下限的灵敏度明显提高,样本经过夜选择性增菌后,检测下限可达59.1 cfu/g,较增菌前提高105倍。结论 建立了一种特异度、灵敏度高的筛查鸭沙门菌血清型方法,为快速、准确鉴定鸭沙门菌和及时处置其造成的公共卫生问题有重要作用。
关键词鸭沙门菌    血清型    聚合酶链式反应    
Rapid detection of Salmonella Anatum in stool samples using PCR
Han Yingying, Duan Yao, Li Jie, Yan Meiying     
Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
This study was supported by US-China Sino on Emerging Infectious Disease(No. 6NU2GGH000961-05-01)and the fund for National Science and Technology Major Project (No. 2017YFC1601200)
Corresponding author: Yan Meiying, Email:yanmeiying@icdc.cn.
Abstract: Objective To establish a polymerase chain reaction assay for the rapid detection of Salmonella Anatum and evaluate its specificity, sensitivity and detection limit. Methods The genomes of Salmonella spp. isolated before August 2015 were downloaded from GenBank database to find certain specific genes which are only present in S. Anatum strains. Primers targeting the specific genes of S. Anatum were designed and the PCR assay was established. The specificity, sensitivity and the detection limit of the assay were evaluated by using pure cultured bacterial strains, clinical and simulated stool samples respectively. Results The PCR assay for the rapid detection of S. Anatum established based on a novel marker gene AW58_15605 in this study had positive amplification of the specific gene for all the S. Anatum strains, including pure cultured bacterial strains and clinical samples, whereas no amplifications were observed for other serotypes of Salmonella and other enteric pathogens causing diarrheal diseases. The specificity and sensitivity of the assay were all 100%. The detection limit of the PCR assay for S. Anatum with purified DNA as template reached 59.1 cfu/g in simulated stool samples after overnight selective enrichment, which was 105 fold higher than that before enrichment. Conclusion The established PCR assay for the rapid detection of S. Anatum based on a novel gene could identify S. Anatum with high specificity and sensitivity. Therefore, it has a good potential for the application in S. Anatum infection clinical diagnosis and outbreak response.
Key words: Salmonella Anatum     Serotype     Polymerase chain reaction    

肠道沙门菌(Salmonella enteric,SP)是引起人类肠炎和菌血症的常见致病菌。多数动物特别是食用动物被认为是非伤寒沙门菌的主要携带者[1]。截至2016年,世界卫生组织(WHO)统计数据显示,全球范围内已鉴定出超过2 500种的沙门菌血清型[2]。我国已有292个血清型报道[3]。传统的血清型鉴定采用血清凝集方法,该方法耗时长、操作繁琐且需要有经验的技术人员;而市场上商品化的沙门菌诊断血清价格昂贵,质量参差不齐,存在交叉凝集现象;且约5%~8%的沙门菌因缺乏荚膜或鞭毛而只能部分或无法确定其血清型[4]

沙门菌不同O抗原及H抗原的组合使沙门菌血清型具有多样性,O抗原及H抗原则由特异的基因及基因簇编码,故利用抗原编码基因的特异性进行分子血清分型为近年来的研究热点[5-7]。除利用多个O抗原及H抗原编码特异基因对沙门菌血清分型外,单一特异基因因实验操作的便捷性及对实验仪器要求等方面更具优势而用于沙门菌血清分型[8]

鸭沙门菌(Salmonella Anatum)为临床常见血清型,近年来监测发现,其H2相抗原与H1,7交叉凝集现象明显,导致多次血清型误判。因此,基于PCR的单一特异基因建立检测方法,对于快速筛查、鉴定鸭沙门菌引起的感染及暴发,以及在基层实验室推广应用有实践意义。通过对鸭沙门菌血清型特异基因(鸭沙门菌特有而其他血清型没有的基因)及其引物进行筛选,建立PCR检测体系,并评价其灵敏度、特异度及在粪便样本中的检测下限。

1 材料与方法 1.1 菌株选择

随机挑选56株鸭沙门菌作为检测灵敏度的菌株,164株肠道常见病原体作为特异度评价的菌株(表 1),包括47种血清型(除鸭沙门菌)的155株沙门菌,如伤寒沙门菌(S.Typhi)、副伤寒沙门菌(S. Paratyphoid)、鼠伤寒沙门菌(S. Typhimurium)、肠炎沙门菌(S.Enteritidis)、德尔卑沙门菌(S.Derby)、阿贡纳沙门菌(S.Agona)、汤普森沙门菌(S. Thompson)、伦敦沙门菌(S.London)和都柏林沙门菌(S.Dublin)等;87株其他肠道常见病原体,如志贺菌(Shigella spp.)、5类致泻性大肠埃希菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、弯曲杆菌(Campylobacter)、邻单胞菌(Plesiomonas)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)等。实验用菌株来自中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所腹泻病室,沙门菌血清型均采用血清凝集试验进行确认。沙门菌抗血清购自丹麦国家食品研究所,并在有效期内使用。

表 1 菌株信息 Table 1 Information of strains used in study
菌种 菌株数
S.Aberdeen(阿伯丁沙门菌) 1
S.Abony(阿邦尼沙门菌) 3
S.Agona(阿贡纳沙门菌) 5
S.Anatum(鸭沙门菌) 56
S.Bareilly(巴雷利沙门菌) 2
S.Berta(贝塔沙门菌) 1
S.Bledam(布利丹沙门菌) 1
S.Bonariensis(波那雷思沙门菌) 1
S.Bovismorbificans(病牛沙门菌) 3
S.Braenderup(布伦登卢普沙门菌) 5
S.Bredeney(布雷登尼沙门菌) 1
S.Cerro(塞罗沙门菌) 2
S.Chincol(钦科沙门菌) 1
S.Choleraesuis(猪霍乱沙门菌) 1
S.Coeln(科隆沙门菌) 1
S.Colindale(科林德尔沙门菌) 1
S.Derby(德尔卑沙门菌) 9
S.Dublin(都柏林沙门菌) 1
S.Duesseldorf(杜塞道夫沙门菌) 1
S.Edmonton(爱德蒙顿沙门菌) 1
S.Eko(埃科沙门菌) 1
S.Enteritidis(肠炎沙门菌) 12
S.Fulica(福利卡沙门菌) 2
S.Give(吉韦沙门菌) 9
S.Hardar(哈达尔沙门菌) 5
S.Havana(哈瓦那沙门菌) 1
S.Hillingdon(希林登沙门菌) 1
S.Hvittingfoss(非丁伏斯沙门菌) 1
S.Heidelberg(海德堡沙门菌) 1
S.Infantis(婴儿沙门菌) 4
S.Israel(以色列沙门菌) 1
S.Javiana(爪哇纳沙门菌) 3
S.Kedouguo(凯杜古沙门菌) 1
S.Kentucky(肯塔基沙门菌) 1
S.Koeningstuhl(科尼斯图沙门菌) 2
S.Liverpool(利物浦沙门菌) 1
S.London(伦敦沙门菌) 1
S.Mbandaka(姆班达卡沙门菌) 5
S.Meleagridis(火鸡沙门菌) 7
S.Montevideo(蒙得维的亚沙门菌) 4
S.Muenchen(慕尼黑沙门菌) 1
S.Muenster(明斯特沙门菌) 4
S.Newport(纽波特沙门菌) 1
S.Othmarschen(奥兹马森沙门菌) 2
S.Oranienburg(奥雷宁堡沙门菌) 1
S.Panama(巴拿马沙门菌) 1
S.ParatyphiA(甲型副伤寒沙门菌) 10
S.Paratyphi B(乙型副伤寒沙门菌) 2
S.ParatyphiC(丙型副伤寒沙门菌) 2
S.Pakistan(巴基斯坦沙门菌) 1
S.Rechovot(雷希伏特沙门菌) 1
S.Rissen(里森沙门菌) 4
S.Rubislaw(鲁比斯劳沙门菌) 1
S.Ruzizi(鲁齐齐沙门菌) 2
S.Saintpaµl(圣保罗沙门菌) 5
S.Schwarzengrund(胥伐成格隆沙门菌) 4
S.Senftenberg(山夫登堡沙门菌) 1
S.Stanley(斯坦利沙门菌) 1
S.Tennessee(田纳西沙门菌) 1
S.Thompson(汤卜逊沙门菌) 1
S.Typhi(伤寒沙门菌) 2
S.Typhimurium(鼠伤寒沙门菌) 9
S.Uganda(乌干达沙门菌) 3
S.Virchow(维尔肖沙门菌) 4
S.Wandsworth(旺兹沃思沙门菌) 1
S.Weltevreden(韦太夫雷登沙门菌) 1
S.Worthington(渥兴顿沙门菌) 3
S.dysenteriae(痢疾志贺菌) 1
S.flexneri(福氏志贺菌) 1
S.boydii(鲍氏志贺菌) 1
S.sonnei(宋内志贺菌) 1
enteroaggregative Escherichia coli(肠黏附性大肠埃希菌) 1
enterotoxigenic E.coli(肠产毒性大肠埃希菌) 26
enteroinvasive E.coli (肠侵袭性大肠埃希菌) 11
extraintestinal pathogenic E.coli(肠致病性大肠埃希菌 )2
enterohemorrhage E.coli(肠出血性大肠埃希菌) 2
V.vulnificus(创伤弧菌) 1
V.cholera O1 and O139(O1和O139群霍乱弧菌) 3
V.parahemolytics(副溶血弧菌) 4
Campylobacter spp.(弯曲杆菌属) 4
Plesiomonas spp.(邻单胞菌属) 2
Y.enterocolitica(小肠结肠炎耶尔森菌) 1
B.cereus(蜡样芽孢菌) 22
K.pneumonia(肺炎克雷伯菌) 4
1.2 引物设计及合成

从GenBank中下载截至2015年8月的所有沙门菌全基因组序列(共3 847条),通过基因组比对,获得鸭沙门菌共有的基因序列(core genome),再与其他血清型沙门菌(pan genome)进行比对,获得鸭沙门菌血清型特异的基因序列。经Alignment分析后,基因序列一致性若 < 50%该基因全长(利用该阈值可尽量减少初筛基因的数量,有利于降低后续实验室验证的工作量)则认为该基因不存在,若≥50%,则认为该基因存在。以特异基因为靶点,利用Primer Premier 5.0(加拿大Premier公司)设计引物,共得到4对引物,经过筛选后获得1对特异性引物,其序列为Anatum2R:5'-GAT GAC TTC ACC TAT TCT GGT AAC G -3',Anatum2F:5'-AAA TCC TTC CCG CTG AAT C-3'。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

1.3 PCR反应体系

反应模板的制备采用热裂解法。反应体系(总体积20 µl)组成为:2×Premix Taq 10 µ(l TaKaRa公司),正、反向引物各0.4 µmol/L,模板DNA 1 µl,加纯水补足至体积为20 µl。使用LabCycler PCR仪(德国Sensoquest)进行扩增反应。扩增条件:95 ℃,5 min;95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,1 min,共30个循环;72 ℃,6 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,使用紫外透射仪观察,确定PCR产物长度,并将部分PCR产物送北京睿博兴科生物科技有限公司进行TA克隆测序,获得的序列进行BLAST比对分析。

1.4 粪便模拟标本的制备

取过夜培养的鸭沙门菌标准株Sa776菌悬液100 µl转接至10 ml LuriaBertani(LB)培养基中,37 ℃振荡培养至对数期(约A值=0.6)。离心弃上清液,集菌、沉淀,用5 ml TE重悬,重复操作1次。重悬菌液计数,获得确切菌的含量。菌悬液以10倍梯度稀释为10-1~10-10,取各稀释梯度的菌液3 ml与1 g健康者粪便样本混匀。同时以不加菌液的粪便作为阴性对照。室温放置1 h,作为粪便模拟样本。取1接种环模拟样品接种至科玛嘉沙门显色培养基,37 ℃过夜培养,观察增菌前目标菌株的生长情况。

1.4.1 制备DNA模板

(1)粗制DNA模板  取粪便模拟样本100 µl加入200 µl TE,涡旋振荡,1 000× g离心1 min后弃沉淀。保留上清液8 000× g离心5 min后弃上清液,沉淀用1 ml TE重悬。振荡离心方法同上,弃上清液,沉淀用100 µl TE重悬,热裂解法制DNA模板。同时以不加菌液的粪便作为阴性对照,提取基因组。

(2)纯DNA模板  使用粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]进行粪便DNA提取、纯化,操作步骤均严格按照说明书进行。以上制备的DNA为增菌前样品,作为PCR反应模板。

1.4.2 增菌培养

将剩余菌液与粪便混合物分别加入6 ml LB或亚硒酸盐-半胱氨酸(SC)增菌液,37 ℃静置培养。分别在培养4、6、16 h取1接种环增菌液接种至科玛嘉沙门显色培养基,37 ℃过夜培养,观察细菌生长情况(增菌后)。同时,取1 ml增菌液按上述方法制备粗制DNA模板,取200 µl增菌液制备纯DNA模板。

2 结果 2.1 筛选可单一扩增特定血清型的引物

经生物信息学分析,获得4个可能的鸭沙门菌特异基因,分别设计特异引物进行PCR扩增。初期利用85株沙门菌(47个血清型和5株鸭沙门菌)进行筛查,筛选出1对可单一扩增全部鸭沙门菌模板的引物Anatum2。后将鸭沙门菌株数扩大至56株再次进行PCR检测,结果56株菌株均为阳性,随机选择其中10株菌的PCR扩增产物进行序列测定。结果显示,扩增片段长度为361 bp,经BLAST比对发现,扩增序列与鸭沙门菌基因AW58_15605(GenBank号:CP014659.2)序列的一致性为100%。该基因编码假想蛋白。利用Anatum2引物扩增其他常见肠道致病菌包括霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌、弯曲杆菌等,结果均为阴性。以上结果表明,利用Anatum2引物建立的PCR反应体系检测鸭沙门菌的敏感度和特异度均为100%。

2.2 粪便模拟标本中引物

Anatum2的检测下限以不同浓度鸭沙门菌粪便模拟样本增菌前后热裂解法粗制DNA模板、试剂盒提取纯化粪便基因组DNA为模板分别进行PCR检测,比较增菌前后、不同增菌时间和使用不同增菌液的PCR方法对样本的最低检测下限,即粪便中最低菌含量(cfu/g)。结果发现,原始样本应用热裂解法和试剂盒提取的DNA最低检测下限均为3.54×106 cfu/g。LB或SC增菌液过夜增菌后,以纯化DNA为模板的PCR检测下限显著降低,为增菌前的10-4~10-5倍,其中以SC增菌效果明显,检测下限低至59.1 cfu/g;以粗提DNA为模板的PCR检测下限的灵敏度则提高102~103倍。LB或SC增菌液增菌4、6 h后,检测灵敏度也有提高,且使用纯化DNA可获得更好的检测效果,LB增菌后的PCR敏感性高于SC,LB增菌6 h和16 h的PCR检测下限相同。SC增菌的检测效果则随时间延长而逐步提高,增菌16 h较4 h提高了1 000倍。对于传统沙门菌分离培养检测而言,增菌前最低检测下限为3.54×107 cfu/g,LB或SC增菌液增菌4、6、16 h后最低检测下限均为2.96×103 cfu/g,检测灵敏度明显提高,见表 2

表 2 粪便增菌前后PCR反应最低检测下限 Table 2 Detection limit of PCR assay for S. Anatum in simulated stool samples before and after enrichment
方法 增菌前 Luria-Bertani培养基增菌时间(h) 亚硒酸盐-半胱氨酸增菌时间(h)
4 6 16 4 6 16
粗制DNA-PCR 3.54×106 ND 5.91×104 2.96×103 ND ND 5.91×104
纯化DNA-PCR 3.54×106 2.96×103 5.91×102 5.91×102 5.91×104 2.96×103 59.10
分离培养 3.54×107 2.96×103 2.96×103 2.96×103 2.96×103 2.96×103 2.96×103
注:ND代表未检测到目的基因;表内数据为菌含量(cfu/g);最低检测下限为粪便中最低菌含量
2.3 临床标本检测结果

为进一步明确建立的鸭沙门菌PCR方法的特异性,对81份临床腹泻患者粪便样本进行鸭沙门菌基因AW58_15605检测,其中68份样本为阳性,包括鸭沙门菌6份、肠黏附性大肠埃希菌(enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)15份、肠致病性大肠埃希菌(extraintestinal pathogenic E. coli,EPEC)10份、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)感染20份、弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肠产毒素性大肠埃希菌和非O1非O139霍乱弧菌各3份、副溶血弧菌5份、其余样本8种常见腹泻病原体[5类致泻性大肠埃希菌、沙门菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、霍乱弧菌、副溶血弧菌、气单胞菌和小肠结肠炎耶尔森菌]分离培养结果为阴性。除6份鸭沙门菌感染标本PCR检测结果为阳性外,其他均为阴性,且健康者粪便样本中也未见目的片段扩增。上述结果进一步说明本研究建立的鸭沙门菌PCR检测方法具有较高的特异度。

3 讨论

沙门菌作为重要的食源性致病菌,广泛存在于动物、食品及环境中,其引起的食物中毒波及范围广,且我国某些菌株存在不同程度的耐药性,给沙门菌病的防控带来极大困难[9]。对沙门菌进行血清学分型可为食物中毒及食源性疾病的流行病学处理提供及时的判断依据,为食品加工企业快速处理污染原料提供参考[4]。鸭沙门菌在自然界中分布普遍,坚果和坚果制品、野生动物、牛肉和肉制品、高铁含量的婴儿食品和临床均可分离到,且部分分离菌株呈明显的多重耐药性[10-14]。快速、准确鉴定鸭沙门菌对了解食品污染状况、菌株耐药水平及其传播情况,以及时处置其造成的公共卫生问题意义重大。

基因组DNA较抗原具有更高的稳定性和敏感性,且检测手段简捷。因此,近年来逐步发展了以PCR技术为手段,通过检测沙门菌DNA鉴别血清型的方法[14]。如de Freitas等[15]ompCsdf IviaBspy为目的基因设计引物,建立多重PCR检测沙门菌及其主要血清型(肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌),应用于鸡肉中的沙门菌检测;Kim等[16]根据鼠伤寒沙门菌(S. Typhimurium)和丙型副伤寒沙门菌(S. Paratyphoid C)的特异序列设计多对引物,建立了多重PCR检测方法,均得到较好效果。此外,还有PCR核糖分型[17]、核苷酸重复序列聚合酶链式反应(trinucleotide repeat sequences⁃PCR,TRS⁃PCR)[18]及芯片杂交[5]等鉴别沙门菌血清型的方法。本研究通过下载GenBank中收录的不同血清型沙门菌基因组进行比对,首次发现鸭沙门菌血清型特异基因序列AW58_15605,该基因编码产物功能未知。设计该基因引物,建立PCR检测体系,经测序分析发现,该段序列除与鸭沙门菌基因序列匹配外,与产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)的一段编码假想蛋白的基因序列一致,故在用该对引物鉴定鸭沙门时最好已确定该菌株为沙门菌。但克雷伯菌和沙门菌在分离培养时菌落形态存在明显差异(培养基上菌落颜色和大小均不同),故可以轻松排除产酸克雷伯菌对鉴定结果的干扰。但以原始样本和利用增菌液为模板进行PCR检测时,需要甄别两者,可联合使用沙门菌属特异引物进行双重PCR,从而迅速地鉴定病原体并确定其血清型。本研究利用鸭沙门菌PCR方法对临床模拟样本进行初步检测,结果表明,该方法具有较高的特异性,有应用于临床快速筛检的潜力。

利用粪便模拟样本进行PCR检测鸭沙门菌发现,增菌可明显提高沙门菌的检出率,且随时间的增加,PCR检测体系的灵敏度逐渐升高,而划线分离培养则无升高趋势,说明PCR检测方法优于传统分离培养。同时研究发现,LB培养液短时间增菌可得到更好的效果,且试剂盒提取基因组较热裂解法检测灵敏度高。但SC过夜增菌的检测灵敏度最高,且纯化DNA检测效果优于热裂解法和传统分离培养。因此,为最大限度地提高检测灵敏度,建议粪便样本使用SC过夜增菌,且使用试剂盒纯化DNA为模板进行PCR检测。但在患者症状较重(粪便中菌含量可能相对较高)的情况下,LB增菌液也可用于粪便中鸭沙门菌的早期快速筛查。

本研究首次建立了基于特异基因AW58_15605的鸭沙门菌PCR检测方法,该方法具有快速、方便、特异性好、灵敏度高的特点。鉴于目前普通PCR方法已在县级、甚至部分乡(镇)级医院和疾病控制系统中广泛应用。本研究建立的检测方法可在现场试行推广,以便扩大样本检测量,进一步验证其特异度、敏感性。经临床大量样本验证后,可用于鸭沙门菌引起的感染和暴发流行筛查。

作者贡献:

韩营营  ORCID0000-0002-9183-7177

韩营营:实验操作,数据分析及论文撰写

段瑶:实验操作

李杰:数据整理,实验指导

闫梅英:论文设计,实验指导,数据分析

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