布鲁氏菌病（布病）是一种危害严重的人兽共患传染病，可感染人、家畜及多种野生动物，并引起动物流产和死胎等，造成极大的经济损失^[1]。布鲁氏菌（Brucella）是布病的致病菌，根据其宿主偏好、致病性以及生化特征不同，一般分为6个经典种：羊种布鲁氏菌（B. melitensis）、牛种布鲁氏菌（B. abortus）、猪种布鲁氏菌（B. suis）、犬种布鲁氏菌（B. canis）、沙林鼠种布鲁氏菌（B. neotomae）和绵羊附睾种布鲁氏菌（B. ovis）^[2]。2007年Foster等^[3]从海洋哺乳动物分离到鲸型布鲁氏菌（B. ceti）和鳍型布鲁氏菌（B. pinnipediae）。2008年田鼠型布鲁氏菌（B. microti）首次从普通野鼠中分离鉴定出来，随后从红狐和土壤中分离出该型布鲁氏菌^[4]。2010年从1位乳腺移植患者分离出1株新种布鲁氏菌B. inopinata^[5]。2009年从狒狒体内分离出1株新型布鲁氏菌菌株^[6]。2012年从青蛙体内分离出了1株新型布鲁氏菌^[7]。新种的发现揭示了布鲁氏菌的自然宿主范围已逐渐扩大到非人类灵长动物和两栖动物。其中羊种、牛种、猪种可造成人的感染，羊种布鲁氏菌致病力最强。

我国在不同阶段布鲁氏菌存在菌种（型）变迁现象，1950－1991年从29个省（自治区、直辖市）分离的羊种布鲁氏菌统计，羊种1型所占比例达53.8%，羊种菌3型占33.2%。20世纪90年代至今，羊种菌3型比例持续增加，高达80%。羊种3型对人、畜均有较强的毒力和侵袭力，且致病力也较强，易引起布病的暴发和流行。布鲁氏菌流行优势种型的改变，是疫情愈演愈烈的根本原因。根据羊种菌表面抗原A和M的成分和比例的差异来区分不同生物型，这种基于血清型的表型鉴定易受诊断血清质量及工作人员主观判断影响，对羊种菌型的鉴定带来干扰。AMOS-PCR是布鲁氏菌种（型）鉴定中最常用的方法之一，具有简单、快速和特异的优点，但该方法无法对羊种菌3个生物型进行鉴别^[8]。因此，寻找特异、稳定的靶点准确地对羊种菌的3个生物型进行鉴定已成为羊种菌鉴定中首要解决的问题。rpoB（编码依赖DNA的RNA聚合酶β亚单位）基因已成为不同种布鲁氏菌鉴定的新的分子标识，该基因可在生物型水平鉴别和区分所有已知布鲁氏菌^[9]。其原理是根据全长rpoB序列（4 134 bp）不同区域出现的点突变特征进行种水平的鉴定。以羊种1型标准菌株16M的rpoB序列（AE009516）为参考序列，羊种2型菌分别在密码子629（GCG-GTG）、985（GCC-GTC）和1 309（CTG-CTA）处发生突变。羊种3型菌仅在密码子1 249（ATG-ATA）处发生突变。依据以上多态性特征，在包含羊种特异密码子的变异区域处（1 249和1 309）设计引物并测序，理论上可用于羊种标准参考菌株1、2和3型的鉴别诊断。

基于布鲁氏菌DNA检测的分子技术的广泛使用，但BCSP-31 PCR ^[10]和16S PCR等仅能在种水平鉴定所有布鲁氏菌^[11-12]。为开展流行病学溯源调查，建立更为精确的鉴定方法十分必要。但布鲁氏菌基因组高度保守，各型布鲁氏菌基因组核苷酸序列同源性极高（>90%），单核苷酸多态性（SNP）是各种（型）菌的主要差异来源，大片段的高变区域在各种（型）间极为罕见^[13]。因此，选择合适的分型靶基因对布鲁氏菌的基因分型和多态性调查极为重要，不仅能用于布鲁氏菌种（型）的快速鉴定，还可用于布鲁氏菌基因多态性及流行病学调查等实用性研究。本研究通过对我国分离的299株羊种布鲁氏菌流行株的rpoB基因多态性进行分析，探索鉴别羊种1、2和3型布鲁氏菌的SNP位点，调查表型与基因型的关联性，为深入开展分子流行病学调查提供基础。

299株布鲁氏菌由中国疾病预防控制中心（CDC）传染病预防控制所布病室鉴定保存，菌株分别来自河北省（66株）、河南省（1株）、内蒙古自治区（58株）、吉林省（1株）、青海省（12株）、山东省（7株）、山西省（38株）、四川省（3株）、新疆维吾尔自治区（30株）、浙江省（8株）、北京市（1株）、广东省（9株）、广西壮族自治区（4株）、海南省（6株）、黑龙江省（26株）、江西省（6株）、辽宁省（2株）、陕西省（3株）、云南省（13株）和重庆市（5株）；其中羊1型菌38株、羊2型菌19株、羊3型菌242株；219株分离自人血、68株分离自羊、4株分离自岩羊、3株分离自牛、2株分离自骆驼、1株分离自鹿及2株来源未知。羊种参考菌株16M（生物1型）、63/9（生物2型）、Ether（生物3型）及牛种544和猪种1330为对照菌株。

ClassⅡ A2型生物安全柜（Forma公司）、恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、GeneAmpPCR仪（Applied Biosystems Inc，USA）、DYY-6C -凝胶电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、GelDocXR自动凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）等。

布氏琼脂（BD公司）；布鲁氏菌阳性血清，A、M因子血清、Tb、Wb、BK₂噬菌体均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布鲁氏菌病室提供；2×EasyTaq PCR Super mix、DNA Marker 2000（TranS 2K）、6×Loading Buffer均购自北京全氏金生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自Qiagen（德国凯杰）。

取传代培养48 h的新鲜布鲁氏菌适量，溶于200 µl灭菌生理盐水中，在空气浴中95 ℃，90 min灭活。随后严格按照QIAamp DNA Mini Kit（250）（细菌核酸提取试剂盒）操作步骤进行。提取后编号，-20 ℃保存备用。

复核菌株采用20 µl反应体系，其中包括2 × Mix Buffer 10 µl，引物各0.4 µl × 10，DNA 1.0 µl，灭菌三蒸水补充体积至20 µl；扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；40个循环。扩增PCR产物上样于1.5%琼脂糖凝胶，经150 V电泳30 min琼脂糖凝胶电泳检测。AMOS-PCR（Abortus/Melitensis/Ovis/Suis）引物名称、序列及扩增片段见表 1。

扩增采用20 µl体系：正、反向引物（10 µmol/L）各0.4 µl，2×EasyTaq PCR Super mix 18.2 µl，模板DNA 1 µl。扩增参数为预变性94 ℃ 3 min，随后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 5 min，33个循环。5 µl PCR扩增产物与1 µl的6×Loading Buffer混匀并加样于1.5%琼脂糖凝胶中，经150 V电泳30 min，在凝胶成像仪中观察并记录结果。获得预期条带的扩增结果，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果用Clustral X2.0软件载入，利用MEGA 6.0软件进行比对分析，分别确定每个菌株的4个多态性位点的核苷酸序列，从而确定菌株的基因型别。rpoB-PCR引物名称、序列及扩增片段见表 2。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成（工作液浓度10 µmol/L），-20 ℃保存、备用。

牛种544、羊种16M和猪种1330获得预期扩增结果，扩增条带分别为498、731和285 bp，阴性对照未见扩增条带。299株布鲁氏菌均有731 bp的阳性扩增条带。部分菌株的AMOS-PCR扩增结果见图 1。

图 1 羊种布鲁氏菌的AMOS-PCR扩增结果 Figure 1 AMOS-PCR amplified result of Brucella melitensis strains 注：M.Marker（DL2000）；1~13.试验菌株；14~16.分别为16M、544和1330阳性对照；-.阴性对照

图选项

3株参考菌株获得了预期的rpoB基因型，羊种生物1型16M为rpoB基因1型[GCG（A）/GCC（A）/ATG（M）/CTG（L）]；羊种生物2型63/9为rpoB基因2型[GTG（V）/GTC（V）/ATG（M）/ CTA（L）]；羊种生物3型Ether为rpoB基因3型[GCG（A）/GCC（A）/ATA（I）/CTG（L）]。本研究中38株羊种生物1型菌；19株羊种生物2型菌；242株羊种生物3型菌，见表 3。两种优势基因型rpoB-2和rpoB-2 variant在大部分地区呈广泛分布，基因型rpoB-1仅分布在青海省和海南省，新基因型rpoB-4仅分布在内蒙古自治区、黑龙江、山西、云南和浙江省，见表 4。

布病作为一种人兽共患传染病，在畜牧业发达地区危害尤其严重。人畜间的感染率、发病率居高不下，极大影响养殖业的健康发展，严重影响农牧民脱贫。羊种布鲁氏菌是我国主要的人畜间病原体，通过深入分析羊种rpoB基因多态性，对建立羊种菌的快速鉴定方法和遗传进化分析有重要意义。羊种布鲁氏菌生物型间有限的生化反应差异常使试验结果难以解释。目前，已知羊种布鲁氏菌的3个生物型鉴别基础仅基于表面抗原的血清学特异性。布鲁氏菌脂多糖的O－多糖及核心寡糖对布鲁氏菌病的诊断及菌种间和型间血清学诊断有重要价值，其O－多糖为4，6－二脱氧－4－甲酰氨基－ D甘露糖残基以1，2－联键连接起来的线性均质多聚体。关于布鲁氏菌脂多糖结构与遗传特征研究较少，羊种菌1型标准菌株16M脂多糖O抗原合成与转移基因包括wbk区域（wbkA、gmd、per、wzm、wzt、wbkB、wbkC）、wbkE、manAO-Ag、manBO-Ag、manCO-Ag、wbkF、wbkD、wboA、wboB。布鲁氏菌光滑型和粗糙型Wbk合成基因差异无统计学意义。无论是与A或M凝集的菌株，涉及聚合化的糖基转移酶基因wboA、wboB、wbkE也未表现出多态性。研究表明，菌株间A或M抗原成分及比例的变化与相关基因的精细表达和调控有关。国外学者利用26株布鲁菌标准株的rpoB基因与羊种16M标准株rpoB基因进行比对分析，发现22处显著变异，从而得到了17个rpoB基因型。此外，尽管牛种生物1、4、5、6、9型的rpoB基因序列完全一致，但rpoB基因在其他布鲁氏菌种间及生物型水平仍表现出良好的多态性，可能具有基因分型的价值^[8]。本实验对299株羊种布鲁氏菌rpoB基因多态性检测发现，有3株为rpoB-1型，103株为rpoB-2型，169株为rpoB-2变异型，24株表现为新的rpoB基因型（命名为rpoB-4），表明我国羊种菌流行株的生物型与rpoB基因型存在较大差异，与先前研究结果相符^[14]。我国分离的299株羊种布鲁氏菌rpoB基因的4个多态性位点的变异主要集中在629和985两个氨基酸位点，而1 249和1 309两个位点的核苷酸序列相对稳定，未见变异。在生物1和2型羊种菌中均有rpoB-1、rpoB-2、rpoB-2变异型和新的rpoB基因型菌株，而生物3型菌仅有rpoB-2、rpoB-2变异性和rpoB-4，未见rpoB-3基因型菌。表明我国羊种菌流行株生物型和rpoB基因型无明显关联性^[15]。34.4%（103/299）的菌株为rpoB -2，56.5%（169/299）的菌株为rpoB-2变种；rpoB-2（包括rpoB-2变异型）为优势基因型且分布于23个省（自治区、直辖市），尽管各地区菌株数量差异较大，两个优势基因型在地区分布上未见明显差异，且与所选菌株数量无关。本研究中来源于动物的羊种菌株数量较少，不同宿主间的基因型分布规律尚不清楚。目前，被感染动物因缺乏有效地移动监管，可造成人源布鲁氏菌优势基因型集中分布。Sayan等^[16]报道58株羊种菌中48株为rpoB-2变种，6株为rpoB-2，4株为rpoB-1，羊种布鲁氏菌的rpoB基因多态性与我国菌株有所差异，提示我国羊种菌流行株和欧洲羊种菌的rpoB基因可能存在不同的进化。

本研究证实，我国羊种布鲁氏菌与国际标准参考菌株的rpoB基因多态性特征有明显差异；不同菌株的rpoB基因多态性对其功能的影响未知，需深入研究探索。299株流行株中未见rpoB-3型菌株，需对更多菌株进行检测，以全面准确地描述羊种布鲁氏菌的rpoB多态性特征，便于分子流行病学调查^[17]。羊种菌的3个生物型在rpoB基因变异中未见明显规律，未对羊种菌3个生物型进行正确鉴别，但从病原菌种（型）间遗传变异及微进化角度提示，布鲁氏菌基因组有高度保守的病原体特征，今后将开展基于羊种菌基因组水平或其他特异性基因片段的SNP鉴别方法的研究，从而建立可行的羊种菌基因鉴别方法。

作者贡献:

李明慧  ORCID：0000-0002-7096-699X

李明慧：rpoB扩增及初稿撰写

刘志国：测序后分析

朴东日：菌株复苏及复核

赵鸿雁、田国忠：AMOS-PCR

姜海：设计及审阅