肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)分为48个血清群，90多个血清型^[1]，可引起侵袭性肺炎球菌性疾病(invasive pneumococcal disease，IPD)，包括菌血症、菌血症性肺炎和脑膜炎等，在＜5岁儿童和老年人群中具有严重的疾病负担^[2]。肺炎球菌疫苗的应用可有效预防IPD，但也会造成肺炎链球菌血清型的替换^[3-7]，导致疫苗免疫逃逸。19A和19F血清型的替换备受关注。有研究表明，通过多位点序列分型(multilocus sequence type，MLST)分析，CC320/271的ST型克隆群在侵袭性肺炎链球菌19A和19F血清型中，可发生荚膜的转换导致血清型的替换^[8-9]。ST分型是针对肺炎链球菌7个管家基因进行的基因分型，当不同ST型的7个管家基因中有4个以上等位基因位点相同时，可将这些ST型聚类为一个克隆群(clonal complex，CC)。同一个CC中的菌株可以有不同的ST型，也可以有不同的血清型，等位基因的变化，可以作为研究菌株基因变异的根据。我国关于侵袭性肺炎链球菌19A和19F基因型研究的数据较少，本研究针对侵袭性肺炎链球菌19A和19F血清型菌株进行多位点序列分型和聚类分析，以掌握肺炎链球菌荚膜转换和血清型替换的趋势，有助于肺炎球菌疫苗应用效果的评价。

本研究中57株侵袭性肺炎链球菌分离自肺炎、脑膜炎患者的脑脊液、血液等无菌部位，来自全国各疾病预防控制中心(CDC)细菌性疫苗可预防疾病监测网络实验室。

所有菌株均经革兰染色(革兰染液试剂盒，法国生物梅里埃公司)、奥普托欣敏感性实验(DDI Optochin，英国OXOID公司)以及胆汁溶解实验(脱氧胆酸钠，美国Sigma公司)进行生化鉴定，采用肺炎链球菌血清荚膜肿胀实验(肺炎链球菌分型诊断血清，丹麦Statens Serum Institut公司)和血清型特异的PCR分型方法确定血清型。

用Promega Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒提取肺炎链球菌基因组DNA，PCR扩增7个管家基因(aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt、ddl)，引物序列参照肺炎链球菌MLST网站(http://spneumoniae.mlst.net/)所提供序列，见表 1。PCR反应体系为30 μl，其中15 μl GoTaq^® Green Master Mix(美国Promega公司)，正向引物(10 μmol/L)1.5 μl，反向引物(10 μmol/L)1.5 μl，DNA模板2 μl，无菌双蒸水10 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。扩增引物即为测序引物，引物合成及基因测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。使用DNAStar软件进行序列分析，序列提交肺炎链球菌MLST网站，获得管家基因的等位基因号及ST型。采用BioNumerics软件处理数据并进行ST型聚类分析。

经生化鉴定以及血清分型，侵袭性肺炎链球菌19A血清型菌株有35株，19F血清型菌株22株。

35株侵袭性肺炎链球菌19A血清型菌株共有6种ST型，其中ST320(29株，82.9%)，ST876(2株，5.7%)，ST4560(1株，2.9%)，ST9230(1株，2.9%)，ST7759(1株，2.9%)，ST6429(1株，2.9%)。22株侵袭性肺炎链球菌19F血清型菌株共有7种ST型，其中ST271(14株，63.6%)，ST236(1株，4.5%)，ST320(2株，9.1%)，ST1937(2株，9.1%)，ST6993(1株，4.5%)，ST9236(1株，4.5%)，ST9240(1株，4.5%)。结果表明在侵袭性肺炎链球菌19A血清型菌株中，ST320为主要的ST型；在19F血清型菌株中，ST271为主要的ST型。

利用BioNumerics软件对19A和19F血清型肺炎链球菌ST数据进行分析，见图 1。

图 1 19A、19F血清型肺炎链球菌ST型的BioNumerics聚类分析 Figure 1 BioNumerics cluster analysis of STs of S. pneumoniae serotype 19A and 19F strains 注：红色部分代表 19A血清型肺炎链球菌菌株，绿色部分代表 19F血清型肺炎链球菌菌株，圆圈大小代表菌株数目多少

图选项

聚类分析结果表明，ST320/271型作为优势ST型，两者的同源性较高。在MLST数据库中查询发现，ST320和ST271中6个管家基因(aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt)的等位基因号相同，只有1个管家基因ddl的等位基因号不同，在ST320中ddl的等位基因号为1，而在ST271中ddl的等位基因号为26，提示ST320和ST271可能起源于同一个ST型。

肺炎链球菌有众多血清型，但引起IPD的主要有20多个血清型。目前肺炎球菌疫苗主要包括两类：肺炎球菌多糖疫苗(PPV)和肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗(PCV)^[10-11]，其中，PCV7疫苗已被PCV13疫苗所替代。PCV7疫苗中包含19F血清型，PCV13相比于PCV7增加了19A血清型，主要是基于美国及其他各国肺炎链球菌流行病学监测数据，发现19A导致的侵袭性肺炎球菌病例上升^{[9, 12-14]}。

对本研究所收集的57株侵袭性肺炎链球菌19A和19F血清型菌株的BioNumerics聚类分析发现，19F血清型的肺炎链球菌不同ST型聚类集中，以ST271为中心，其余6种ST型均匀分布在ST271周围。在MLST数据库中查询发现，ST271与其他6种ST型均只有一个管家基因的等位基因号不同；相比较而言，19A血清型的肺炎链球菌不同ST型分布松散，与其主要基因型别ST320相比，ST4560、ST7759和ST9230的7个管家基因的等位基因位点均与其不同，表明肺炎链球菌19A血清型菌株的基因型更具有多变性和复杂性。

另外，本研究发现ST320/271为侵袭性肺炎链球菌19A和19F血清型菌株的主要基因型，ST271型全部为19F血清型菌株，19A血清型菌株中未检测到ST271。19A血清型肺炎链球菌主要型别为ST320，19F血清型菌株中也检测到2株ST320型别，表明如果有荚膜转换发生，ST320基因型的肺炎链球菌更易在19A和19F血清型中进行荚膜转换，可能与ST320的多药耐药(MDR)特点有关^[15]。

有研究表明，CC320/271克隆群菌株最初出现于19F血清型肺炎链球菌中，后出现于19A血清型肺炎链球菌中，故认为19F和19A血清型肺炎链球菌之间发生了荚膜转换^[8]。CC和ST是基因分型，而荚膜则与肺炎链球菌血清型相关，属于表型分型，根据荚膜多糖免疫化学特性的不同，将肺炎链球菌分为多个血清型。因此，研究认为CC320/271克隆群菌株的基因型并未发生改变，只是荚膜转换导致了19F血清型和19A血清型这一表型的变化。关于其转换机制，有研究认为PCV7应用产生的疫苗选择压力可能导致了这种转变^[16]，也有研究表明19A血清型菌株的增加可能与抗生素的选择压力有关^[17]。

本研究发现19F菌株中的ST236，ST320，ST1937，ST6993，ST9236，ST9240均与ST271仅有1个等位基因位点的差异，除ST320型外，这些ST型都有可能在基因型不发生改变的情况下，发生荚膜转换而导致表型的改变，从而表现为19A血清型肺炎链球菌。

随着PCV13的应用，疫苗所覆盖血清型引起的疾病减少，某些ST型别会在选择压力下发生荚膜转换产生“疫苗逃避”。对此，我国在未来推广肺炎球菌疫苗的同时，对于19F与19A之间的荚膜转换和流行趋势应引起关注，为评价PCV13疫苗效果提供依据。

作者贡献:

严彩芳  ORCID：0000-0002-3844-3590

赵红庆  ORCID：0000-0002-4423-0612

严彩芳：负责文献收集，实验室检测工作，数据处理及论文撰写

赵红庆：参与文献收集，数据处理

高源、朱兵清、徐丽：数据处理

高朝辉、邵祝军：指导工作，参与论文修改