朊病毒病(prion diseases)又称可传播性海绵状脑病(TSEs)，是一类可感染人类及动物中枢神经系统的神经退行性疾病，包括散发型及遗传型克-雅病(creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、吉斯特曼综合征(gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome，GSS)、致命性家族型失眠症、库鲁病及变异型克-雅病(variant CJD，vCJD)，还包括牛的海绵状脑病(bovinc spongiform enccphalopathy，BSE)及羊的瘙痒症等^[1-2]。该病潜伏期长，致死率100%。目前认为，朊病毒病的致病因子为正常构象的朊蛋白(PrP^C)发生错误折叠，形成了具有致病性的异常朊蛋白(PrP^Sc)。朊病毒病的病理特征主要表现为神经元丢失，空泡样变性，胶质细胞增生以及淀粉样斑块沉积^[1]。然而，朊病毒病中神经退行性变的调控机制仍不十分明确。

NF-κB作为重要的转录调控因子，在中枢神经系统中发挥着重要功能。不仅参与生理功能的调节，同时与中枢神经系统的神经退行性变息息相关^[3-7]。NF-κB家族成员包括：NF-κB1，NF-κB2，RelA(p65)，RelB以及c-Rel^[3]。NF-κB以二聚体形式发挥作用，在静息状态下，NF-κB与IκB结合存在于胞浆中，当NF-κB经典信号通路被激活时，IκB发生磷酸化、泛素化，从而被进一步降解，NF-κB二聚体被释聚，核定位信号暴露^[8]。随后，NF-κB二聚体入核结合到目的基因的κB位点，调节目的基因的转录^[9]。有研究表明，NF-κB的激活可保护神经元对抗Aβ肽段所诱导的凋亡^[10]。在帕金森(PD)患者中，黑质区域多巴胺神经元中p65入核比例明显增高^[11]，表明NF-κB活性增强在一定程度上具有保护神经元的作用。在朊病毒病中，NF-κB的潜在功能尚不十分清楚。本研究选取羊瘙痒因子毒株139A感染小鼠模型为研究对象，通过检测NF-κB(p65)在羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中的含量变化及分布情况，初步探究NF-κB在朊病毒病发病过程中的作用及机制。

实验小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠Scrapie-139A毒株为中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒病室保存；p65兔源多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin鼠源单克隆抗体购自中国华兴博奥公司；NeuN鼠源单克隆抗兔购自美国Millipore公司；GFAP鼠源单克隆抗兔购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠二抗购自美国Jackson实验室，用于蛋白免疫印迹检测；Alexa Fluor 488标记的羊抗兔，Alexa Fluor 568标记的羊抗鼠荧光二抗购自美国Thermo公司；ECL Kit购自美国PerkinElmer公司；免疫组织化学使用的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、DAB购自中国博士德公司。

取正常小鼠及感染139A毒株的小鼠脑组织，按照100 mg/ml比例加入裂解液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% Nonidet P-40，0.5% sodiam deoxycholate，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5)，匀浆器研磨制成10%(m/v)匀浆液，2 000 r/min离心30 min，取上清。

取脑组织匀浆10 μl，加入5 × Loading buffer 2.5 μl，100 ℃水浴10 min，8% SDS-PAGE电泳，半干式电转至NC膜，室温下，用TBS配制5%的脱脂乳封闭NC膜2 h，随后分别包被一抗p65兔源多克隆抗体(1：1 000)及β-actin(1：5 000)，4 ℃孵育过夜。利用含有0.1%吐温20的TBST洗膜3次，每次10 min，随后包被相应的羊抗兔二抗(1：5 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后进行ECL显影，X胶片曝光观察。

制备取正常小鼠及139A感染终末期小鼠脑组织，10%甲醛浸泡过夜，自来水冲洗3 h，放入75%乙醇4 ℃过夜。次日依次放入85%乙醇(1 h)，95%乙醇(1 h)，100%乙醇Ⅰ(1 h)，100%乙醇Ⅱ(2 h)，二甲苯Ⅰ(1 h)，二甲苯Ⅱ(0.5 h)，浸蜡Ⅰ(2 h)，浸蜡Ⅱ(3 h)，石蜡包埋。制成5 μm石蜡切片备用。

取正常小鼠及139A感染终末期小鼠脑组织切片，脱蜡至水，将其浸于0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中，放入微波炉，中高火抗原修复30 min。复温后，利用3%双氧水进行内源阻断10 min，5% BSA室温封闭15 min，p65兔源多克隆抗体(1：50)一抗包被，4 ℃过夜。次日，PBS洗片5次，每次10 min，随后，37 ℃包被羊抗兔二抗1 h，最后进行DAB复染，封片观察。

取正常小鼠及139A感染终末期小鼠脑组织切片，脱蜡至水，将其浸于枸橼酸钠缓冲液中，放入微波炉，中高火抗原修复30 min。复温后，0.3% Triton-X100室温通透30 min，随后，正常山羊血清封闭20 min，一抗包被(p65/NeuN，p65/GFAP)，4 ℃过夜。次日，37 ℃复温15 min，PBS洗片5次，每次10 min，随后，37 ℃包被二抗1 h，DAPI复染30 min，封片观察。

每组实验重复3次以上，利用Image J软件对蛋白质免疫印迹法(western blot，WB)结果进行灰度分析，利用Image-Pro Plus 6.0对免疫组织化学结果进行灰度分析，利用GraphPad Prism 6.0软件统计分析并制图，数据以均数±标准差(x±s)表示，t检验分析组间差异。

为探究NF-κB(p65)在139A感染小鼠脑组织中的变化规律，首先利用WB对139A感染终末期小鼠及正常对照小鼠脑组织中p65含量进行检测，对p65及β-actin条带灰度值作比对，并进行统计分析。由图 1可知，在139A感染小鼠脑组织中，p65含量明显低于正常对照组(Ctrl：7.99 ± 1.86；139A：2.51 ± 1.27，P＜0.05)。

图 1 p65在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中含量的蛋白质免疫印迹法检测 Figure 1 WB detection of expression of p65 in brains of scrapie-139A infected mice 注：A为正常小鼠组；B为139A感染小鼠组

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为进一步验证以上结果，利用免疫组织化学对139A感染终末期小鼠及正常对照小鼠大脑皮层中p65含量进行检测，对p65信号强度进行统计分析。由图 2可知，在139A感染小鼠的大脑皮层中，p65含量明显低于正常对照组(Ctrl：38.71 ± 6.02；139A：17.05±5.01，P＜0.01)，进一步验证了利用WB所检测的结果。

图 2 p65在139A羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中含量的免疫组织化学检测 Figure 2 HIC detection of expression of p65 in brains of scrapie-139A infected mice

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p65的活化有利于提高神经元对外界损伤的抵抗作用，而p65的活化又与多种蛋白相关。为探究139A感染不同时间的小鼠脑组织中p65及相关蛋白的含量变化，利用WB对正常小鼠脑组织及139A感染不同时间的小鼠脑组织进行检测，对其灰度值进行统计分析。由图 3可知，139A感染不同时间的小鼠脑组织中p65含量呈先升高后下降的趋势，但仅有139A感染终末期样本差异有统计学意义(Ctrl：8.81±0.44；139A：6.21±0.41，P＜0.05)。

图 3 p65蛋白在139A感染小鼠不同时间点的变化 Figure 3 Dynamic analysis of p65 expression in brains of scrapie-139A infected mice

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神经元中p65的激活有利于其存活，而胶质细胞中p65的激活多表现为对神经元的损伤作用。为检测p65在中枢神经系统中不同细胞的表达情况，利用免疫荧光方法检测p65在正常小鼠及139A感染终末期小鼠大脑皮层中的分布情况。由图 4可知，在正常小鼠及139A感染小鼠脑组织中，p65阳性信号均与神经元细胞标记物NeuN存在共定位，而与星形胶质细胞几乎无共定位现象。提示p65在中枢神经系统中主要分布于神经元细胞。

图 4 p65在中枢神经系统中的定位情况（40×） Figure 4 Location of p65 in central nervous system

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本研究中，通过WB及免疫组织化学的方法对139A感染小鼠脑组织样本中p65含量进行检测。在139A感染小鼠终末期脑组织中，p65含量明显低于正常对照组。同时，小鼠脑组织切片的免疫组织荧光结果表明，无论是正常小鼠还是139A感染终末期小鼠中，p65均主要分布于NeuN阳性细胞，而不是GFAP阳性细胞。由于神经元丢失是朊病毒病典型的病理特征之一^[1]，以上结果提示在139A感染终末期小鼠脑组织中，p65含量的减少可能源于神经元中p65含量的减少以及神经元的丢失。神经元细胞中的p65有利于神经元的存活及抵抗有害刺激所致的神经元损伤^[3]，故神经元中p65含量的减少会阻碍神经元的存活，可能在一定程度上加速了朊病毒病的疾病进程。大量研究表明，胶质细胞中存在NF-κB的激活，同时可诱导毒素的产生^[12-13]，本实验室近期研究结果也发现，在139A感染小鼠脑组织中的小胶质细胞中存在NF-κB的激活。然而朊病毒病感染终末期，神经元中NF-κB的下调似乎起主导作用。针对神经元与小胶质细胞中NF-κB的动力学研究需要进一步的研究。

本研究中，WB检测139A感染小鼠不同时间点的动态分析结果显示p65含量早期增高，后逐渐下降，终末期时含量明显低于正常对照组。在疾病早期，神经元受到不良刺激后可能产生保护性应激反应导致p65表达增高，而随着疾病的发生发展应激反应逐渐消失，神经元细胞中p65表达逐渐下降，同时伴随着神经元细胞死亡，从而导致139A感染小鼠脑组织中p65总量逐渐下降。而Akt与IκBα含量并无明显变化，可能与其分布及转录调控机制有关，有待进一步的研究验证。

在其他神经退行性疾病中，同样有NF-κB信号通路发生异常的报道，尤其是阿尔兹海默病。Aβ肽段作用于培养的细胞可诱导NF-κB的激活^[14-15]，在阿尔兹海默病的动物模型中，特定的脑区可见到NF-κB表达的增高，一定程度上反映了阿尔兹海默病的炎症反应^[16-17]。然而，在本研究中，NF-κB在139A感染小鼠模型中含量明显降低。同样，其他细胞水平的研究也得到了相似的结果^[18]。NF-κB在阿尔兹海默病和朊病毒病中所表现出的变化不同，其原因尚不明确。与阿尔兹海默病相比，朊病毒病的临床期较短，因此，推测在朊病毒病中，NF-κB的下调可能与神经元快速丢失相关。

作者贡献:

马月  ORCID：0000-0002-1031-5175

马月：实验操作，结果整理与数据分析，论文撰写

高利萍、肖康、王晶：部分问题分析解决

董小平、石琦：负责整体设计及论文的修改