不同基因型结核分枝杆菌的分布与流行具有明显的地区差异，目前研究显示，结核分枝杆菌北京基因型是世界范围内快速传播及暴发流行的主要基因型，中国是结核病高负担国家之一，国内耐多药结核分枝杆菌的主要基因型是北京基因型^[1]。对耐多药结核分枝杆菌北京基因型的快速鉴定将有助于监测本地区耐多药结核病的暴发、流行。近年研究显示，北京基因型是否与耐药相关一直存在争议^[2-3]，尤其是与喹诺酮类药物耐药相关性研究较少。因此，本研究通过鉴定宁波地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株基因型，并对北京基因型与喹诺酮类药物耐药相关性进行分析，为本地区耐多药肺结核的有效防控提供科学依据。

2014-2016年宁波地区11个县(市、区)耐药监测期间共收集培养阳性菌株1 481株，其中结核分枝杆菌1 274株(86.02%)，非结核分枝杆菌207株(13.98%)。1 274株结核分枝杆菌中，耐药菌株为370株(29.04%)，耐多药菌株106株(8.32%)。本实验研究纳入的全部106例耐多药结核分枝杆菌临床分离株经菌种鉴定及一线抗结核药物耐药检测，确定为同时耐异烟肼和利福平的耐多药临床分离株。结核分枝杆菌H₃₇RV标准株来源于中国疾病预防控制中心(CDC)。

分离培养、菌种鉴定及药敏试验培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司。结核分枝杆菌DNA提取、PCR扩增等相关试剂及技术服务购自上海桑尼生物科技有限公司。

按照《结核病诊断实验室检验规程》进行^[4]。药物敏感性检测采用世界卫生组织/国际防痨和肺病联合会(WHO/IUATLD)《耐药监测指南》推荐的1%比例法对耐多药结核分枝杆菌菌株进行氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LFX)、莫西沙星(MXF)3种喹诺酮类药物的耐药性检测，含药培养基中药物终浓度分别为OFX 2.0 μg/ml，LFX 2.0 μg/ml，MXF 0.25 μg/ml。耐药百分比=(含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数)×100%，以耐药百分比>1%定义为耐药。

取一接种环L-J培养基上生长状态良好菌落溶于400 μl TE(pH值8.0)中，振荡混匀后沸水浴15 min，12 000 g/min离心3 min取上清。

根据北京基因型菌株RD105片段缺失特点，参照Chen等^[5]建立的检测方法进行检测。

采用SPSS 16.0对北京基因型和非北京基因型菌株的喹诺酮类药物耐药率、人群分布特征等进行χ²检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

性别和户籍在不同基因型耐多药菌株中差异无统计学意义(χ²=0.294和χ²=0.145，P＞0.05)，治疗分类在不同基因型耐多药菌株中差异有统计学意义(χ²=4.318，P＜0.05)。北京基因型耐多药菌株年龄组主要集中在25~45岁，非北京基因型菌株年龄组主要集中在45~64岁。不同基因型耐多药菌株人群分布特征见表 1。

106株耐多药结核分枝杆菌中，83株(78.30%，83/106)属于北京基因型，23株(21.70%，23/106)属于非北京基因型。83株北京基因型菌株中，28株耐喹诺酮类药物(33.73%，28/83)；23株非北京基因型菌株中，6株耐喹诺酮类药物(26.09%，6/23)，差异无统计学意义(χ²=0.483，P＞0.05)，见表 2。

性别、户籍情况及治疗分类在不同基因型耐喹诺酮的耐多药菌株中差异均无统计学意义(χ²值分别为0.012、1.107和2.242，P＞0.05)。北京基因型耐喹诺酮的耐多药菌株年龄组主要集中在25~45岁，非北京基因型主要集中在>64岁，见表 3。

近年研究显示，北京基因型结核分枝杆菌与结核病的暴发流行及多耐药性相关，对北京基因型的监测有助于控制结核病的传播及暴发流行。国内耐多药结核分枝杆菌的主要基因型是北京基因型^[1]。目前研究显示^[5-6]，RD105缺失基因是鉴定北京基因型菌株的分子标志物。本研究应用该技术对耐多药结核分枝杆菌临床分离株进行了基因型鉴定，显示北京基因型菌株是宁波地区耐多药结核分枝杆菌传播的优势菌群，针对人群分布特征研究发现性别、户籍情况在不同基因型间差异无统计学意义。治疗分类在不同基因型间差异有统计学意义，新发耐多药患者中北京基因型占比较高，复治耐多药患者中非北京基因型占比较高，造成这一现象的原因可能是北京基因型耐多药结核分枝杆菌的传播力较强，是新近感染菌株中的优势菌群。这些现象提示，在今后的工作中需加强北京基因型菌株的监测和追踪，这对本地区耐多药结核病的有效防控具有重要意义。

喹诺酮类药物(氧氟沙星、左氧氟沙星及莫西沙星)作为耐多药结核病治疗方案中的核心药物，其有效性显得极为重要。由于喹诺酮类药物在药品管控、临床经验用药等方面存在弊端，且近年来我国广泛用喹诺酮类治疗社区获得性肺炎^[7]、耐药结核病等肺部感染性疾病(经济发达地区尤为常见)，造成耐喹诺酮类药物的菌株传播及流行。有数据表明^[8]，宁波地区耐喹诺酮类药物的耐多药肺结核疫情较为严峻。本次研究显示，纳入研究的106株耐多药结核分枝杆菌的喹诺酮总耐药率达32.08%(34/106)，处于较高水平，与国内其他地区报道结果相符^[9-11]，且喹诺酮类药物耐药谱中以耐氧氟沙星为主，占91.18%(31/34)，这一现象可能与本地区氧氟沙星滥用有关，提示今后需进一步规范喹诺酮类药物尤其是氧氟沙星的临床使用。34株耐喹诺酮类药物的耐多药菌株以复治病例为主(76.47%，26/34)，原因可能是复治患者治疗效果差，传染期长，更易对喹诺酮类药物产生耐药，因此在实际工作中需开展喹诺酮类药物的耐药性检测，针对复治患者制订个性化的化疗方案。

耐多药结核分枝杆菌喹诺酮耐药机制的研究对于提高耐多药结核病的治愈率和预防广泛耐药结核病的发生具有十分重要的意义。结核病分子流行病学表明，部分地区北京基因型菌株与耐药结核病的传播有关，北京基因型更易对抗结核药物耐药，且耐药这一因素也促使了北京基因型广泛传播^[12]。国内关于北京基因型菌株与耐药的关系研究存在争议，Pang等^[13]认为北京基因型与氧氟沙星等药物耐药相关，而另有研究显示^[14-15]，耐药菌株在北京和非北京基因型中的比例差异无统计学意义。本次研究对北京基因型与喹诺酮类耐药相关性进行了探讨，发现两者无关，印证了相关研究的观点，DNA促旋酶的编码基因gyr突变是结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药的主要原因^[16-18]。

综上所述，纳入研究的宁波地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株主要以北京基因型为主，但该研究样本量还有待提高，存在一定局限性。北京基因型菌株作为耐多药结核分枝杆菌的优势菌群需加强监测及防控，同时该基因型与喹诺酮耐药的关系还需进一步深入研究。

作者贡献:

车洋  ORCID：0000-0003-3085-8123

车洋：实验研究、数据分析及撰写文稿

杨天池：参与数据分析

平国华：参与实验研究

林律：参与实验研究