重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因同源性分析
  疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (12): 958-961

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周俊英, 乐英棒
ZHOU Jun-ying, YUE Ying-bang
重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因同源性分析
Gene homology analysis on methicillin resistant Staphylococcus aureus isolated in intensive care unit
疾病监测, 2017, 32(12): 958-961
Disease Surveillance, 2017, 32(12): 958-961
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.12.015

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收稿日期:2017-07-19
重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因同源性分析
周俊英, 乐英棒     
武汉大学中南医院检验科, 湖北 武汉 430071
摘要目的 对重症监护病房(ICU)感染患者和环境监测分离出的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行耐药性及基因同源性进行分析。方法 对医院ICU医务人员手及高频接触的物品表面进行采样,对感染患者标本进行细菌培养,菌株采用Vitex 2 Compact微生物鉴定药敏系统进行检测,并用肠杆菌科基因间重复序列的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对其进行基因分型,采用NTSYS-PC 2.0软件对ERIC-PCR扩增产物进行聚类分析。结果 ICU感染患者标本中有33株金黄色葡萄球菌,16株为MRSA,其检出率为48.48%,ICU医务人员手及环境表面检出6株金黄色葡萄球菌,5株为MRSA,其检出率为83.33%。21株MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁耐药率为0,对青霉素耐药率为100%,对环丙沙星、红霉素、左氧氟沙星等耐药率超过了80.00%;ERIC-PCR电泳结果显示,最大的分子质量约为450 bp,最小的分子质量约为100 bp,带型各不相同;对21株MRSA扩增产物进行聚类分析,DNA同源性在46.00%~67.00%之间,同源性在68.00%时可分为3个大类,第1、2、3、4、5、6、9、11、13、17菌株亲缘关系较近。结论 ICU临床分离出的MRSA呈多重耐药,临床医生应根据药敏结果合理用药;ICU环境分离出的MRSA也呈现多重耐药,与临床分离株耐药表型有一定的同源性,但基因同源性关联不大;ICU环境物体表面存在MRSA感染风险。
关键词耐甲氧西林金黄色葡萄球菌    重症监护病房    肠杆菌科基因间重复序列    基因分型    同源性    
Gene homology analysis on methicillin resistant Staphylococcus aureus isolated in intensive care unit
ZHOU Jun-ying, YUE Ying-bang     
Department of Clinical Laboratory, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China
This study was supported by the fund for Scientific Research Project of Hubei Provincial Health and Family Planning Commission (No.WJ2017H0021)
Corresponding author: ZHOU Jun-ying, Email: 1348548858@qq.com.
Abstract: Objective To understand the drug susceptibility and gene homology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates from the patients and environmental samples in intensive care unit (ICU). Methods The swabs of medical personnel hands and equipment surfaces frequently contacted in ICU were collected and ICU patients' clinical samples were taken for the culture of bacteria. The identification and drug susceptibility of the strains were tested with Vitex Compact system, the homology was detected by using enterobacterial repetitive intergenic sequence (ERIC)-PCR, the cluster analysis was performed with software NTSYS-PC 2.0. Results A total of 33 strains of S. aureus was detected from ICU patients, 16 strains were identified as MRSA, the positive rate was 48.48%. Six strains of S. aureus were isolated from ICU medical personnel hands and environment, in which 5 were MRSA (83.33%). The resistant rates of 21 strains of MRSA to vancomycin, linezolid, teicoplanin were 0. The resistant rate to penicillin was 100%, the resistant rates to ciprofloxacin, erythromycin and levofloxacin were >80%; ERIC-PCR electrophoresis results showed that the maximum molecular band was about 450 bp, the smallest molecule was about 100 bp, with different profiles for 21 different strains of MRSA. The homologies of 21 strains ranged from 46.00% to 67.00%, when homology was >68.00%, it could be divided into 3 categories, the strain 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 11, 13 and 17 had close relation. Conclusion The clinical MRSA isolates in ICU were multi drug resistant, clinicians should use antibiotics according to the drug susceptibility test results; the MRSA isolates in ICU environment also showed multi drug resistance, and the resistant phenotypes had certain homogeneity with clinical isoaltes, but the gene homology had no obvious relation. The environment of ICU was a MRSA infection source.
Key words: MRSA     ICU     ERIC     Genotype     Homology    

金黄色葡萄球菌是引起医院感染的重要致病菌,其中重症监护病房(intensive care unit,ICU)是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染的重灾区[1]。MRSA医院感染可能来自于医生和护士的手、物品、水和空气等环境中的病原体,由于ICU患者病情危重、住院时间长及一些侵入性操作等因素,其获得MRSA医院感染的可能性大且危险性高[2]。ICU患者多为其他病房甚至外院转来的危重患者,病情缓解稳定后需转出ICU至其他病房,导致其在医院MRSA的播散上起到重要作用。

本实验主要通过对武汉大学中南医院ICU患者的标本与医院ICU医务人员手及环境表面进行MRSA的分离鉴定和耐药检测,并运用肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术对MRSA基因分型,分析MRSA的同源性。

1 材料与方法 1.1 临床菌株

收集2016年3-12月武汉大学中南医院ICU病房分离出的金黄色葡萄球菌,共33株;采集ICU环境标本41份,包括医生护士的手、桌面、电脑键盘、鼠标、病历本、门把手、换药室桌面、水龙头、床架、床头桌、床单、呼吸机、听诊器以及空气等。

1.2 质控菌株

金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和ATCC29213。

1.3 试剂和仪器

血平板由广州迪景微生物科技有限公司提供,MH琼脂和药敏纸片由英国OXOID公司提供,ERIC引物由上海生工公司合成,TaqDNA聚合酶和dNTPs由Fermantas公司提供,DNA Marker由HBI公司提供,PCR扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪,TGL-16K高速离心机、Mini UV-1微型紫外投射仪均由珠海黑马医学仪器有限公司提供,POWER PAC 3000型电泳仪由美国BIO-RAD公司提供。

1.4 实验方法 1.4.1 细菌的分离和鉴定

按《全国临床检验操作规程》进行[3],药敏试验采用K-B法。

1.4.2 引物序列

ERIC1序列:ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C;ERIC2序列:AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G。

1.4.3 细菌DNA模板制备

按实验室常规的酚/氯仿法提取。

1.4.4 ERIC-PCR反应体系

总体积20 μl,包括模板DNA为2 μl,10×PCR缓冲液2 μl,MgCl2 25 mmol/L 1.2 μl,dNTP (10 mmol/L)1 μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)1 μl,ERIC1和ERIC2各2 μl,双蒸水8.8 μl。

1.4.5 反应条件

循环参数:94 ℃ 5 min预变性,94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸4 min,共30个反应循环,最后72 ℃ 10 min。PCR反应产物采1.5 g/L琼脂糖凝胶(1×TBE)电泳,电压100 V,电泳10 min,紫外灯下判读结果

1.5 聚类分析

将ERIC-PCR电泳谱带数据转换成矩阵,用0和1代表谱带的无和有,然后运用NTSYS-PC 2.0软件对21株MRSA扩增产物进行相似性分析,聚类分法选用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)。

2 结果 2.1 细菌鉴定结果

采集ICU医务人员手及环境表面中标本共41份,分离出金黄色葡萄球菌6株,其中5株为MRSA,检出率为12.19%,分别来自桌面、医护人员手、不同房间的空气和床单;ICU患者标本中共分离出33株金黄色葡萄球菌,16株为MRSA,占金黄色葡萄球菌检出率为48.5%,这16株病例中,男性10例,女性6例,15株来自肺部感染,1株来自腹腔引流液。

2.2 药敏实验

16株MRSA临床患者分离株中,所有菌株对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁敏感,耐药率为0%,MRSA菌株对青霉素、苯唑西林和头孢西丁耐药率为100%,环丙沙星、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素耐药率分别为93.75%、81.25%、75.00%、87.50%、62.50%、50.00%,复方新诺明和氯霉素耐药率相对较低,分别为31.25%和18.75%。

ICU环境标本分离出5株MRSA,其对氯霉素、万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁、妥布霉素耐药率为0,对青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率为100%,对青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、苯唑西林、红霉素呈高度耐药,耐药率>80%,对复方新诺明、庆大霉素、克林霉素也产生了较高的耐药性,耐药率>40%,见表 1

表 1 ICU患者标本与环境标本分离出的MRSA耐药率 Table 1 Drug resistant rates of MRSA isolates from patients and environment samples in ICU
药物名称 患者标本耐药率(%) 环境标本耐药率(%)
头孢西丁(FOX) 100.00(16/16) 100.00(5/5)
复方新诺明(SXT) 31.25(5/16) 60.00(3/5)
青霉素(P) 100.00(16/16) 100.00(5/5)
氯霉素(C) 18.75(3/16) 0.00(0/5)
左氧氟沙星(LEV) 87.50(14/16) 100.00(5/5)
庆大霉素(CN) 62.50(10/16) 40.00(2/5)
环丙沙星(CIP) 93.75(15/16) 100.00(5/5)
万古霉素(VA) 0.00(0/16) 0.00(0/5)
苯唑西林(OX) 100.00(16/16) 100.00(5/5)
利奈唑胺(LZD) 0.00(0/16) 0.00(0/5)
克林霉素(DA) 75.00(12/16) 40.00(2/5)
红霉素(E) 81.25(13/16) 80.00(4/5)
替考拉宁(TEC) 0.00(0/16) 0.00(0/5)
妥布霉素(TOB) 50.00(8/16) 0.00(0/5)
2.3 ERIC-PCR电泳结果

采用ERIC-PCR方法对5株环境标本分离出的MRSA和16株ICU患者标本分离出的MRSA以及质控菌株进行基因分析。1~16为患者标本分离株,17~21为环境分离株,电泳结果显示最大的分子质量约为450 bp,最小的分子质量约为100 bp,见图 1

图 1 21株金黄色葡萄球菌ERIC-PCR检测电泳结果 Figure 1 ERIC-PCR electrophoresis results of 21 strains of S. aureus 注:M:Marker; 1~16为患者标本分离株;17~21为环境分离株
2.4 ERIC-PCR结果聚类分析

运用NTSYS-PC 2.0软件对21株MRSA扩增产物进行相似性分析,21株菌的DNA同源性在46.00%~67.00%之间。同源性在68.00%时可分为3类。菌株第1、2、3、4、5、6、9、11、13、17、8为一类,菌株第12、15、19、21为一类,菌株第7、14、18、20、10、16为一类,菌株第1、2、3、4、5、6、9、11、13、17亲缘关系较近,菌株第12、15、19、21亲缘关系较近,菌株第7、14、18、20亲缘关系较近,相关性达90.00%,特别是在第一类中,有9株是痰培养,1株为实习生的手部细菌培养,相似度极高,见图 2

图 2 ERIC-PCR结果聚类分析 Figure 2 Cluster analysis of ERIC-PCR results
3 讨论

MRSA是ICU内发生高患病率及高死亡率的重要病因,MRSA大部分表现为多重耐药,不仅对β-内酰胺类抗菌药耐药,还对喹诺酮类、氨基苷类和大环内酯类等抗菌药物耐药。万古霉素被认为是治疗MRSA感染的最后一道防线,但近几年又发现了对万古霉素中介或耐药的MRSA[4],给临床治疗MRSA感染带来了极大的困难。

本实验从ICU环境标本分离出5株MRSA,分别来自桌面、ICU医护人员手、2份空气标本和ICU床单,对氯霉素、万古霉素、利奈唑胺等耐药率为0%,对青霉素、环丙沙星等呈高度耐药,耐药率>80.00%,这说明ICU环境中存在较为严重的多重耐药MRSA,为控制医院感染,应加强病房环境微生物监测,定期对医务人员的手、物体表面、空气等进行细菌学监测,加强消毒隔离措施,严格执行无菌技术操作,特别是手卫生规范的执行,及时采取预防控制措施。

ICU临床标本分离的16株MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁完全敏感,对青霉素、环丙沙星等多种抗生素呈高度耐药,耐药率>80.00%,这表明ICU的MRSA多重耐药现象比较严重,临床医生应正确合理使用抗菌药物,延缓或减少耐药菌株的产生,保证正确、有效的临床治疗。

MRSA是引起医院感染的重要致病菌之一[5-6],国内外均有报道ICU环境分离出MRSA,且与临床分离标本有高度同源性,说明他们可能来自同一菌株的播散。

从药敏实验结果和耐药表型分析,ICU环境标本与临床分离标本有一定的表型同源性,但不完全一致。它们对青霉素、环丙沙星、苯唑西林、红霉素都呈高度耐药;但环境菌株对氯霉素、妥布霉素敏感,临床分离菌株却呈现不同程度的耐药;环境菌株对复方新诺明耐药,而临床分离菌株对复方新诺明耐药率却较低。运用ERIC-PCR基因分型结果显示:ICU医生的手分离出的17号菌株与环境分离第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13共9株MRSA有相同的条带,特别是在前一类中,有9株是肺部感染患者分离株,1株为实习生的手部细菌培养,相似度极高,说明有可能来自同一传染源,医护人员特别是实习生手部卫生依从性较差,是造成局部感染流行的主要原因。因此必须加强ICU全体工作人员消毒隔离知识的培训,严格做到在接触患者和诊疗操作前后进行洗手或手消毒,彻底清洁和消毒可能被病原体污染的环境表面和设备,专人负责层流空气净化系统的日常保养,彻底清洗回风口过滤网,同时制定层流病房空气净化系统管理制度,定期更换过滤器或根据空气培养的结果增加更换次数,以确保层流病房空气洁净,从而达到减缓并控制ICU耐药菌局部流行。

作者贡献:

周俊英   ORCID:0000-0002-4698-1401

周俊英:主要负责耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的同源性分析

乐英棒:负责收集菌株、药敏试验及临床资料整理

参考文献
[1]
Chen Q, Jin H, Xu H, et al. Distribution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from ICU[J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2016, 26(11): 2447-2449. (in Chinese)
陈琦, 金慧, 徐虹, 等. ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分布特征分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2016, 26(11): 2447-2449.
[2]
Shi XY, Chen QR, Yu XY, et al. Rapid monitoring and prevention of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in ICU[J]. International Journal of Laboratory Medicine, 2015, 36(7): 877-879. (in Chinese)
史小英, 陈启容, 余新玉, 等. ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速监测及防控[J]. 国际检验医学杂志, 2015, 36(7): 877-879.
[3]
Shang H, Wang YS, Shen ZY. National laboratory operating procedure[M]. 4th ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2015: 648-653. (in Chinese)
尚红, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2015: 648-653.
[4]
Zarpellon MN, Gales AC, Sasaki AL, et al. Survival of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus on hospital surfaces[J]. J Hosp Infect, 2015, 90(4): 347-350. DOI:10.1016/j.jhin.2015.04.005
[5]
Zhu JQ, Jiang Y. Drug resistance of Staphylococcus aureus in 2011[J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2013, 23(6): 1428-1430. (in Chinese)
诸军权, 蒋银. 2011年金黄色葡萄球菌耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2013, 23(6): 1428-1430.
[6]
Liu Z, Yang K, Yao J, et al. Antimicrobial resistance and clinical epidemic trend of Staphylococcus aureus[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2013, 48(4): 409-412. (in Chinese)
刘周, 杨凯, 姚杰, 等. 金黄色葡萄球菌临床流行趋势及耐药性分析[J]. 安徽医科大学学报, 2013, 48(4): 409-412.