急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARI)是儿科常见病、多发病，对儿童健康造成严重威胁。据世界卫生组织资料，每年约有400万5岁以下儿童死于ARI^[1]。在ARI中，90%以上病原体是病毒。常见的呼吸道病毒包括流感病毒A型(IFV-A)和B型(IFV-B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)、副流感病毒1~4型(PIV 1~4)、鼻病毒(RV)、腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、冠状病毒(CoV)、人博卡病毒(hBoV)、肠道病毒(EV)等，本研究收集ARI儿童鼻咽部分泌物，并对上述14种常见呼吸道病毒进行检测。

2015年冬至2016年春在郑州大学第三附属医院门诊部随机收集ARI患儿鼻咽部分泌物。纳入标准：仅诊断为ARI的患儿。入选病例共483例，急性上呼吸道感染(acute upper respiratory tract infection，AURI)包括感冒、急性扁桃体炎、疱疹性咽峡炎、急性喉炎，急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infection，ALRI)包括毛细支气管炎、支气管肺炎、急性支气管炎，临床诊断参照《诸福棠实用儿科学》(第8版)^[2]。在所有患儿中临床资料：男性299例，女性184例。年龄29 d至＜6月龄者59例，6月龄至＜1岁者98例，1~2岁者196例，3~5岁者106例，≥6岁者24例。急性上呼吸道感染416例，急性下呼吸道感染67例。冬季351例，春季132例。

患儿就诊当天由专业人员采集咽拭子标本1份，放入浓度为1 : 4的Hank平衡盐溶液中，将标本保存于-80 ℃冰箱，72 h内用标本冷冻箱运送至厦门大学分子实验室进行检测。

采用多重媒介探针熔解曲线分析技术^[3-4]检测IFV-A、IFV-B、RSVA、PIV 1~4、RV、AdV等呼吸道病毒。在多重荧光PCR的基础上，结合多色荧光探针熔解曲线分析技术与媒介探针技术，建立单管或闭管的四色检测体系，通过熔解曲线Tm值的不同，区分不同的病原体，从而实现单管同时检测多种病毒。

咽拭子标本提取：采用柱式病毒RNA抽提纯化试剂盒(EZ-10 Spin Column Viral Total RNA Extraction Kit)，试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，编号B518667。在T3 PCR仪(Biometra，德国)完成反转录反应。

多重体系检测：PCR扩增引物、媒介探针、荧光探针和阳性质粒携带的基因组序列由上海生工生物工程有限公司合成。多重体系成分：25 μl的PCR反应体系包含：1×Taq01 buffer(厦门致善生物科技股份有限公司)，7 mmol/L MgCl₂，0.4 mmol/L dNTPs(上海岭兰生物科技有限公司)，40 μmol/L dUTP(赛默飞)，2.0 U Taq01 DNA聚合酶(厦门致善生物科技股份有限公司)，0.01 U UNG酶(赛默飞)。整个过程在SLAN96S实时PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)上完成，总计时长约为2.5 h。

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计数资料以百分比表示，采用χ²或Fisher精确检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

483例标本中，检出病毒141例，总阳性率为29.19%，单一病毒感染132例，占27.33%。IFV阳性率8.49%，PIV 5.38%，RSV 3.93%，RV 2.90%。ARI混合感染主要是双重感染，检出9例(1.86%)，见表 1、2。

不同年龄组ARI病毒检出率不同，差异有统计学意义(χ²=11.087，P=0.026)。29 d至＜6月龄病毒总检出率高于3~5岁及≥6岁者，组间比较差异有统计学意义(χ²=7.068，P=0.008；χ²=6.810，P=0.009)。CoV在29 d至＜6月龄检出率高于6月龄至＜1岁、1~2岁(P=0.028；P=0.003)，IFV-B在1~2岁检出率高于6月龄至＜1岁、3~5岁组(P=0.017；P=0.022)，以上2种病毒检出率组间差异有统计学意义，见表 3。

男性患儿病毒检出率27.76%(83/299)，女性患儿病毒检出率31.52%(58/184)。男性与女性病毒检出率差异无统计学意义。

AURI病毒检出率为28.85%，ALRI病毒检出率为31.34%。AURI与ALRI病毒总检出率差异无统计学意义，其中RSVA在ALRI检出率为8.96%，与AURI检出率比较差异有统计学意义(χ²=9.042，P=0.003)，见表 3。

ARI冬季病毒检出率为30.48%，春季检出率为25.76%。冬、春季病毒感染总检出率差异无统计学意义，其中RV春季检出率高于冬季，IFV-B冬季检出率高于春季，2种病毒冬春季检出率差异有统计学意义(χ²=4.999，P=0.025；χ²=6.876，P=0.009)，见表 3。

儿童急性呼吸道感染与多种因素相关^[5-6]。本研究表明ARI儿童不同年龄组病毒检出率存在差异，性别对呼吸道病毒总检出率无影响。

从年龄分析，29 d至＜6月龄婴儿病毒检出率最高，阳性率为42.4%。＜6月龄婴儿虽然可以从母体中获得抗体，但还未产呼吸道分泌型IgA，故呼吸道感染机会仍较大。幼儿活动范围渐广，接触病原体机会增多，病毒感染概率增大，随着免疫系统不断完善，接触病原体增多，产生特异性抗体，病毒感染减少。

从病毒分析，ARI阳性率为29.19%，高于张晋雷等^[7]报道南阳市17.97%，可能与检测方法、病毒类型、病种等有关。本地区病毒检出率依次是IFV、RSV、RV、AdV、hMPV、CoV。流感病毒造成主要感染和死亡是IFV-A。20世纪全球共暴发3次甲型流感病毒大流行：1918年西班牙H1N1大流感、1957年亚洲H2N2大流感以及1968年中国香港地区H3N2大流行^[8]，21世纪第一次大流感是2009年墨西哥H1N1，每次流感大流行都严重威胁人类的生命和健康^[9]。本研究IFV-A阳性率2.28%，与田蔓等^[10]报道的2010年南京地区(直接免疫荧光法)阳性率2.34%基本相同，低于何静等^[11]报道的上海地区(巢式多重反转录聚合酶链反应和实时荧光定量法)13.36%，高于李犁平等^[12]报道的2013年长沙地区(直接荧光免疫快速检测)0.01%。IFV-B主要感染人类，引起局部暴发流行^[13-14]。本研究中IFV-B阳性率为6.21%，且冬季阳性率高于春季，从年龄上分析，IFV-B在1~2岁检出率高于6月龄至1岁、3~5岁组，吉隆坡报道74% IFV-B感染为5岁以下儿童，平均年龄为2岁^[15]。PIV感染主要是婴儿和儿童多见，并且有其显著的流行病学特点^[16]。Fé等^[17]报道在热带国家，大多数PIV感染的儿童在门诊被诊断为ARI。本研究PIV-3型检出率为4.76%，明显高于PIV-1、2型。Weinberg等^[18]报道与RSV、IFV相比，PIV感染患儿住院费用较高，所以应重视PIV感染。RSV阳性率3.93%，RSVA在ALRI明显高于AURI，由此可见RSV是婴幼儿ALRI重要的病毒病原，增加婴幼儿家庭负担，应加以重视。RV阳性率为2.90%，且春季RV阳性率明显高于冬季，可能与区域及气候有关^[19]。本研究中CoV阳性率为1.86%，年龄越小检出率越高。双重感染各地区检出率不同，本地区检出9例(1.86%)。有研究报道1岁以下儿童双重感染较单一病毒感染多^[20]，这可能与机体免疫系统发育不完善及对呼吸道病毒暴露少有关。本研究混合感染检出例数有限，需增加样本量，研究混合感染与年龄、季节、病种、混合感染类型等的关系，混合感染可以是病毒之间，也可以是与细菌、非典型病原体混合感染，混合感染与接受抗菌药物的关系均需进一步研究^[21]。

ARI对儿童健康造成严重威胁。本研究表明2015年冬至2016年春季郑州大学第三附属医院儿科门诊RSV、IFV、PIV和RV在儿童中发病率较高，为临床诊断、治疗、预防及相关疫苗制备^[22]及本地区呼吸道病毒流行病学提供了可靠的依据。

作者贡献:

程琳琳  ORCID：0000-0001-8673-7457

程琳琳：收集资料、撰写文章

杨玉霞：修改文章

郭亚琳：收集资料