2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 闫革彬, 牛桓彩, 舒高林, 李东迅, 吴杨
- YAN Ge-bin, NIU Huan-cai, SHU Gao-lin, LI Dong-xun, WU Yang
- 北京市昌平区农村饮用水中铜绿假单胞菌耐药性及分子流行病学特征研究
- Antibiotic resistance and molecular characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolated from rural drinking water in Changping district, Beijing
- 疾病监测, 2017, 32(9): 764-767
- Disease Surveillance, 2017, 32(9): 764-767
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.09.014
-
文章历史
- 收稿日期：2017-05-12
铜绿假单胞菌是非发酵需氧的革兰阴性杆菌，常见于粪便、土壤、水和污水等环境中，可通过易感组织(伤口和黏膜等)、污染水或接触污染的外科器械而感染，引起严重的并发症，且不断出现耐受多种抗生素的菌株，已被世界卫生组织(WHO)确认为院内感染的病原之一。铜绿假单胞菌并非潜在致病菌，而是完全致病菌，具有多种致病途径，是引起人类疾病的一种危险因素[1]。国际权威饮用水标准-欧盟《饮用水水质指令》和WHO《饮用水水质准则》中将铜绿假单胞菌作为细菌指标(0/250 ml)进行检测，虽然我国生活饮用水检测标准(GB/T 5750.12-2006) 未对铜绿假单胞菌进行检测，但食品和饮水中铜绿假单胞菌时有检出，且由其引起的食物中毒也有报道[2]。为了解昌平地区农村饮用水中铜绿假单胞菌耐药谱分布、致病性及分子流行病学特征，本研究对分离自昌平地区农村饮用水中36株铜绿假单胞菌进行药敏实验、毒力基因检测及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型，现将结果报道如下。
1 材料与方法 1.1 菌株来源昌平区农村自备井出厂水或管网末梢水样品共计105份。
1.2 仪器和试剂 1.2.1 仪器主要仪器有恒温培养箱(日本三洋公司)，6 W/366 nm紫外灯(北京博士创科技公司)，McFarland标准比浊仪(法国梅里埃公司)，水浴摇床(德国优莱伯公司)，VITEK2微生物鉴定仪(法国梅里埃公司)，PCR仪、脉冲场凝胶电泳仪及配套设备和凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2.2 试剂及耗材CN琼脂培养基、金氏B培养基、乙酰胺肉汤及LB琼脂(北京陆桥公司)；哥伦比亚血琼脂平板、革兰阴性细菌鉴定卡、非发酵革兰阴性细菌药敏卡(AST-GN09) 和氧化酶试剂(生物梅里埃中国公司)；SeaKem Gold琼脂糖购自美国Lonza公司；蛋白酶K(德国Merck公司)；限制性内切酶SpeⅠ、XbaⅠ(美国New England Biolabs公司)；2×T5 Super PCR Mix(北京擎科新业公司)；孔径0.45 μm滤膜(美国密里博公司)，所有试剂及耗材均在有效期内使用。
1.3 方法 1.3.1 菌株分离及鉴定按照GB/T 8538-2008，采用滤膜法，将250 ml水样用孔径0.45 μm成品灭菌滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，36 ℃±1 ℃恒温培养箱中培养48 h，选取CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或能够在CN琼脂选择性培养基上生长且氧化酶阳性、紫外灯照射下产生荧光、能利用乙酰胺产氨的革兰阴性无芽孢杆菌，并经系统生化鉴定为铜绿假单胞菌[3]。
1.3.2 抗生素敏感性实验对36株铜绿假单胞菌用全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK2 Compact进行抗生素药敏检测，AST-GN09非发酵革兰阴性细菌药敏卡抗菌药物信息和最低抑菌浓度(MIC)结果判读标准见表 1[4]。
| 抗菌药物 | MIC判读标准(μg/ml) | ||
| 敏感(S) | 中介(I) | 耐药(R) | |
| 哌拉西林/他唑巴坦(TZP) | ≤16/4 | 32/4~64/4 | ≥128/4 |
| 头孢他啶(CAZ) | ≤8 | 16 | ≥32 |
| 头孢吡肟(FEP) | ≤8 | 16 | ≥32 |
| 氨曲南(ATM) | ≤8 | 16 | ≥32 |
| 亚胺培南(IPM) | ≤2 | 4 | ≥8 |
| 美罗培南(MEM) | ≤2 | 4 | ≥8 |
| 庆大霉素(GM) | ≤4 | 8 | ≥16 |
| 妥布霉素(TM) | ≤4 | 8 | ≥16 |
| 阿米卡星(AN) | ≤16 | 32 | ≥64 |
| 环丙沙星(CIP) | ≤1 | 2 | ≥4 |
| 左氧氟沙星(LEV) | ≤2 | 4 | ≥8 |
| 哌拉西林(PIP) | ≤16 | 32~64 | ≥128 |
基因组DNA提取采用水煮法：取LB平板培养基上铜绿假单胞菌单克隆菌落于1.5 ml离心管中，加入500 μl 1×TE缓冲液并研磨至菌液混浊一致，放入100 ℃水浴煮10 min，10 000 r/min离心15 min，取200 μl上清液(DNA)于-20 ℃保存。10对毒力基因(lasI、lasR、rhlI、rhlR、toxA、plcH、rhlAB、lasB、aprA、fliC)引物[5]及退火温度见表 2，采用2×T5 Super PCR Mix对上述毒力基因进行PCR扩增，严格按照说明书配置PCR扩增体系并进行扩增反应。阳性PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列分析，将结果输入GenBank数据库比对和确证。
| 毒力基因 | 引物 | 引物序列(5′~3′) | 片段大小(bp) | 退火温度(℃) |
| lasI | F | CGT GCT CAA GTG TTC AAG G | 295 | 55 |
| R | TAC AGT CGG AAA AGC CCA G | |||
| lasR | F | AAG TGG AAA ATT GGA GTG GAG | 130 | 55 |
| R | GTA GTT GCC GAC GAC GAT GAA G | |||
| rhlI | F | TTC ATC CTC CTT TAG TCT TCC C | 155 | 55 |
| R | TTC CAG CGA TTC AGA GAG C | |||
| rhlR | F | TGC ATT TTA TCG ATC AGG GC | 133 | 55 |
| R | CAC TTC CTT TTC CAG GAC G | |||
| toxA | F | GGA GCG CAA CTA TCC CAC T | 150 | 55 |
| R | TGG TAG CCG ACG AAC ACA TA | |||
| aprA | F | GTC GAC CAG GCG GCG GAG CAG ATA | 993 | 55 |
| R | GCC GAG GCC GCC GTA GAG GAT GTC | |||
| rhlAB | F | TCA TGG AAT TGT CAC AAC CGC | 151 | 55 |
| R | ATA CGG CAA AAT CAT GGC AAC | |||
| plcH | F | GAA GCC ATG GGC TAC TTC AA | 307 | 55 |
| R | AGA GTG ACG AGG AGC GGT AG | |||
| lasB | F | TTC TAC CCG AAG GAC TGA TAC | 153 | 55 |
| R | AAC ACC CAT GAT CGC AAC | |||
| fliC | CW45-F | GGC AGC TGG TTN GCC TG | 1 020 (type a) | 55 |
| CW46-R | GGC CTG CAG ATC NCC AA | 1 250 (type b) |
按照报道的铜绿假单胞菌PFGE操作方案[6]，用限制性内切酶SpeⅠ、XbaⅠ进行酶切，以沙门菌标准株H9812作为分子质量标记。PFGE图像用BioNumerics (Version 5.0) 软件根据UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages)方法进行聚类分析。
2 结果 2.1 菌株分离情况105份水样中分离到36株铜绿假单胞菌，分离率为34.29%(36/105)。其中27株分离于出厂水，9株分离于末梢水，见图 1。
|
| 图 1 36株铜绿假单胞菌的PFGE聚类图及毒力基因谱 Figure 1 Dendrogram of PFGE patterns and virulence genes profile of 36 P. aeruginosa strains |
| |
抗生素敏感实验结果判读参照美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)标准，见表 1。36株铜绿假单胞菌对哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、阿米卡星(AN)、庆大霉素(GM)、妥布霉素(TM)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)12种抗生素完全敏感(100%)。
2.3 毒力基因检测情况36株铜绿假单胞菌均含毒力基因lasI、lasR、rhlI、rhlR、rhlAB、lasB，即携带率为100%。31株携带毒力基因toxA(86.11%)，26株携带毒力基因plcH(72.22%)，未检出含aprA和fliC毒力基因的菌株。根据毒力基因检出情况，发现36株铜绿假单胞菌携带6~8种毒力基因，可分为4种毒力基因谱(分别描述为T1~T4型)，其中T1型(lasI、lasR、rhlI、rhlR、toxA、plcH、rhlAB、lasB)25株(69.44%)，T2型(lasI、lasR、rhlI、rhlR、toxA、rhlAB、lasB)6株(16.67%)，T3型(lasI、lasR、rhlI、rhlR、rhlAB、lasB)4株(11.11%)，T4型(lasI、lasR、rhlI、rhlR、plcH、rhlAB、lasB)1株(2.78%)(图 1)。
2.4 PFGE型别36株铜绿假单胞菌经PFGE分析发现菌株间的相似系数为89%~100%，共得到11个PFGE型别(0001~0011)，其中0003(7株)、0010(9株)为主要型别(图 1)。主要毒力基因谱T1型多存在于PFGE型别0003、0010和0011中，也在其他PFGE型别中散在分布。
3 讨论铜绿假单胞菌是引起医院内感染的病原菌之一，常引起术后伤口感染，抗药性强，广泛存在于土壤、水等环境中[7]。生活用水除被人们直接饮用外，还用于日常生活中。如果铜绿假单胞菌污染生活用水，极易造成水源性传染病的暴发及流行。
铜绿假单胞菌表型极不稳定，与其基因型别有关，因此研究铜绿假单胞菌毒力基因分布有助于了解其临床菌株的流行病学特征[7]。群体感应系统(quorum sensing，QS)调控铜绿假单胞菌中毒力基因的表达，检测、鉴定QS可提供临床菌株表达毒力基因的信息。铜绿假单胞菌拥有2种QS系统，即Las(lasI、lasR、lasB)和Rhl(rhlI、rhlR、rhlAB)。有报道显示，QS系统中的基因lasI、lasR、lasB、rhlI、rhlR、rhlAB在铜绿假单胞菌临床菌株中的分布差异具有统计学意义[8]，而本实验中分离自生活饮用水中的铜绿假单胞菌均携带上述6种基因。毒力基因toxA编码外毒素A(exotoxin A)，在铜绿假单胞菌临床株(如尿路感染、呼吸道感染、烧伤感染等)中具有高检出率[9-11]，此次研究中携带toxA毒力基因的环境菌株也高达86.11%(31/36)，提示这些菌株可能具有高感染性。碱性蛋白酶(alkaline protease，aprA)是铜绿假单胞菌中重要的毒力因子，本研究中未检出。有研究显示营养丰富的环境有助于携带aprA基因的菌株生长[7]，而此次研究中的菌株均分离自生活饮用水，营养缺乏，可能是未检出aprA基因的原因还有待研究。鞭毛在铜绿假单胞菌感染初期起重要作用，铜绿假单胞菌有2种类型的鞭毛蛋白(a型和b型)，鞭毛基因(fliC)在铜绿假单胞菌中的分布与疾病的选择压力有关[7]，此次研究中的铜绿假单胞菌均来自环境，无疾病选择压力，未检测出携带fliC基因的菌株。
PFGE分型显示，昌平区铜绿假单胞菌基因型呈多态性，PFGE型别0003(7株)、0010(9株)为主要型别，其他PFGE型别则散在分布。主要毒力基因谱T1型主要存在于PFGE型别0003、0010和0011中，PFGE型别0003与0010、0011的相似系数相差较大，并不能说明毒力基因谱与PFGE型别之间的关系。
北京市昌平区农村生活饮用水主要为出厂水污染，需制定相应的处理措施，确保农村地区生活饮用水的安全性，减少水源性传染病的暴发及流行；同时本研究还构建本地区铜绿假单胞菌的基础数据库，可为铜绿假单胞菌疾病的防控提供参考依据。
作者贡献:
闫革彬 ORCID：0000-0001-5501-538X
闫革彬：文章技术指导
牛桓彩：文章实验完成
舒高林：样品采集
李东迅：文章修改
吴杨：实验操作
| [1] |
Qian BQ. The new problems of Pseudomonas sp.[J]. Foreign Medicine:Microbiology Section, 1986, 9(3): 137-138. (in Chinese) 钱伯钦. 假单胞菌属的新问题[J]. 国外医学:微生物学分册, 1986, 9(3): 137-138. |
| [2] |
Shen Y, Yang ZL, Yue F. Pseudomonas aeruginosa isolated from poisoning food[J]. Zhejiang Journal of Preventive Medicine, 2010, 22(3): 45-46. (in Chinese) 沈瑛, 杨正林, 岳凤. 食物中毒标本中检出铜绿假单胞菌[J]. 浙江预防医学, 2010, 22(3): 45-46. |
| [3] |
General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People′s Republic of China, Standardization Administration of the People′s Republic of China. GB/T 8538-2008 Methods for examination of drinking natural mineral water[S]. Beijing: Standards Press of China, 2009. (in Chinese) 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 8538-2008饮用天然矿泉水检验方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009. |
| [4] |
Wayne PA. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. CLSI, 2011.
|
| [5] |
Sabharwal N, Dhall S, Chhibber S, et al. Molecular detection of virulence genes as markers in Pseudomonas aeruginosa isolated from urinary tract infections[J]. Int J Mol Epidemiol Genet, 2014, 5(3): 125-134. |
| [6] |
Zhou Y, Wang H, Wei CY, et al. Application of pulse-field gel electrophoresis in field investigation of Pseudomonas aeruginosa[J]. Applied Prev Med, 2013, 19(6): 331-334. (in Chinese) 周艳, 王红, 韦程媛, 等. 脉冲场凝胶电泳技术在铜绿假单胞菌现场调查中的应用研究[J]. 应用预防医学, 2013, 19(6): 331-334. |
| [7] |
Wang H, Bédard E, Prévost M, et al. Methodological approaches for monitoring opportunistic pathogens in premise plumbing: A review[J]. Water Res, 2017, 117: 68-86. DOI:10.1016/j.watres.2017.03.046 |
| [8] |
Senturk S, Ulusoy S, Bosgelmez-Tinaz G, et al. Quorum sensing and virulence of Pseudomonas aeruginosa during urinary tract infections[J]. J Infect Dev Ctries, 2012, 6(6): 501-507. |
| [9] |
Kumar R, Chhibber S, Gupta V, et al. Screening & profiling of quorum sensing signal molecules in Pseudomonas aeruginosa isolates from catheterized urinary tract infection patients[J]. Indian J Med Res, 2011, 134(2): 208-213. |
| [10] |
Goldsworthy MJH. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa and MRSA within a catheter-associated urinary tract infection biofilm model[J]. Biosci Horiz, 2008, 1(1): 28-37. DOI:10.1093/biohorizons/hzn008 |
| [11] |
Nikbin VS, Aslani MM, Sharafi Z, et al. Molecular identification and detection of virulence genes among Pseudomonas aeruginosa isolated from different infectious origins[J]. Iran J Microbiol, 2012, 4(3): 118-123. |