自1928年英国科学家亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，抗菌药物的应用使得全球每年有数千万人受益。随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌不断涌现，“超级细菌”的产生和快速传播使得细菌耐药已成为国内、外高度关注的重大公共卫生问题之一。高效、便捷、实用性强的耐药细菌检测方法对于大规模监测细菌耐药、探究耐药机制、防控耐药细菌流行传播十分重要。目前已有的细菌耐药性检测方法可分为经典方法即细菌药物敏感性检测和新技术两大类。细菌药物敏感性试验分为细菌药物敏感性定性检测、定量检测以及商品化的自动药敏检测及分析系统；细菌耐药性检测新技术方法包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测法、实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)检测法、基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术的检测方法、基因芯片检测法、全基因组测序技术以及微流控技术检测法等。

本文将对目前细菌药物性检测技术方法进行介绍，综述其各自特点和适用范围，为从事细菌耐药领域研究和监测、预警的人员提供技术信息参考。

1 细菌耐药性检测经典方法

细菌药物敏感性试验，是目前国内、外临床和实验室最常用的细菌耐药性检测方法，有纸片法、琼脂稀释法、肉汤稀释法、浓度梯度法等，其中除纸片法外，其余方法均可以获得相对精确的药物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。近十几年来，借助工业技术的创新，已出现商品化自动药敏检测及分析系统，由于其操作流程的自动化和标准化，目前广泛应用于临床抗感染诊断和治疗以及基层实验室细菌耐药性的日常检测^[1]。

1.1 细菌药物敏感性定性检测

Kirby-Bauer纸片法(K-B法)是将一定量抗菌药物固定到特定的纸片中，利用纸片上药物的弥散作用在纸片周围的培养基上形成浓度梯度，观察纸片周围有无抑菌圈，获得药物对菌株抑菌圈直径的大小。K-B法自20世纪40年代建立以来，由于其操作简便、费用不高、结果稳定、可以灵活选择待测抗菌药物等特点，成为临床、实验室研究中最经典的定性的药敏检测方法^[2-3]。

1.2 细菌药物敏感性定量检测

细菌药物敏感性定量检测的经典方法有琼脂稀释法和肉汤稀释法，经不断改良后演变为目前实验室常用的微量琼脂稀释法和微量肉汤稀释法，其基本原理均是将菌株接种到含有一系列稀释浓度药物的肉汤或琼脂培养基中，观察菌株的生长状况，能够获得菌株MIC值。该方法是细菌药物敏感性和耐药性检测的金标准。此外，法国梅里埃公司开发了一种基于浓度梯度法的E-TEST纸条，其原理是将一系列浓度的药物固定在纸条上，利用纸条上药物的弥散作用在纸条周围的培养板上形成一系列浓度梯度，观察纸条周围抑菌圈的形状，抑菌圈与纸条吻合处的数值，即为药物MIC值。相比K-B法只可以粗略区分敏感、中介和耐药^[4]。上述3种方法均可以获得菌株的MIC值，这对监测菌株药物敏感性的变迁，掌握菌株耐药性的流行趋势具有重要意义，但因其操作繁琐，影响因素较多，费用较高等原因，临床实验室应用该方法相对较少。

1.3 细菌药物敏感性结果的判读

无论是K-B法得到的抑菌圈直径的大小，还是稀释法和浓度梯度法获得的MIC数值都需要转换为敏感或耐药等更直观的结果以指导临床药物的选择。目前国际上有美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)和欧盟药敏试验标准委员会(european committee on antimicrobial susceptibility testing，EUCAST)2个全球公认的机构来制定药物敏感性判断标准。CLSI分析药代/药效动力学和临床研究，建立抗菌药物敏感性试验方法、解释标准及质量控制参数，根据细菌对抗菌药物的MIC值或抑菌圈直径将判读折点分为敏感、中介和耐药，用于临床分离株的常规抗菌药物敏感性试验以及临床商品化设备评价；EUCAST在药代/药效动力学、耐药机制、临床研究基础上，将流行病学界值(epidemiological cut oFF values，ECOFFs)纳入分析，可用于临床、设备评价及流行病学等更广泛的领域，但其涵盖的抗菌药物种类、细菌种类和CLSI略有不同。1998年我国卫生部将CLSI制定的药敏标准定为标准颁布以来，临床微生物实验室主要参照CLSI的标准开展药敏试验和结果判读^[5]。但随着细菌耐药问题日益严重，耐药性不仅是临床问题，而且涉及人类活动的各个层面，因此EUCAST的流行病学意义也得到了越来越多研究者的认可和使用。

1.4 商品化自动药敏检测及分析系统

目前常见的商品化自动药敏检测及分析系统包括梅里埃VITEK 2全自动细菌鉴定及药敏分析系统、Thermo全自动药敏分析系统、BD Phoenix Automated Microbiology系统等。商品化自动药敏检测及分析系统大大缩减了传统药敏检测方法的工作量，在有纯培养物的条件下，仅需简单的菌悬液制备过程即可上机，获得与传统药敏试验相符的结果，特别适合临床微生物实验室的需求。Bobenchik等^[6]使用VITEK 2检测134株金黄色葡萄球菌和84株肠球菌耐药情况，细菌的敏感、耐药情况与CLSI推荐的肉汤稀释法一致，虽然VITEK 2不如稀释法可获得相对精确的MIC值，仅获得对应CLSI折点的MIC范围，但对于临床需求VITEK 2显示出极高的可信性。商品化自动药敏检测及分析系统拥有快速、自动化、半定量等优势的同时，也存在其本身不可忽略的缺陷，一方面自动化设备、耗材昂贵，另一方面药物选择的灵活性差，难以满足科学研究的需求，其更多应用于临床微生物实验室。

2 细菌耐药性检测新技术

细菌药物敏感性试验首先需要获得纯培养物，对于难培养及非培养菌无法适用，且耗时较长，有时候难以满足目前临床重症、急症感染的快速诊断和对症治疗的需求。随着PCR技术、全基因组测序技术、微流控技术、MALDI-TOF MS技术等新兴技术的推广，针对细菌耐药性检测新技术的探索逐渐深入，多种细菌耐药性检测新技术方法日益成熟。

2.1 基于培养的微流控检测技术

微流控芯片技术，又称芯片实验室，是一种以在微米尺度空间对流体进行样品处理、反应、检测等复杂操作为主要特征的科学技术^[7]。Choi等^[8]利用微流体琼脂糖通道(microfluidic agarose channel，MAC)系统建立了一种快速细菌耐药性表型检测技术。该技术使用显微镜追踪MAC系统中单细胞细菌的生长，与不同抗菌药物培养条件下单细胞细菌的时间延迟图像进行对比，来确定该菌对该种抗菌药物的MIC值，该法仅在3~4 h内就可获得MIC值，为细菌耐药性快速检测提供了新的方法。Mach等^[9]使用电化学传感器进行活细胞计数，从而判定该菌的MIC值，整个过程约2.5 h，并取得了与传统药敏检测方法一致的结果。该检测技术依赖于分离自样本的纯培养物，可在短时间内获得准确的细菌对不同药物的药物敏感谱，为临床危重感染患者的救治提供快速、准确、信息量丰富的检测结果。

2.2 基于MALDI-TOF MS技术的检测方法

MALDI-TOF MS技术是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是先将生物分子电离，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同形成蛋白质指纹谱，然后经软件与数据库中标准指纹图谱进行对比，从而达到鉴别的目的。该技术最初应用于菌种鉴定，具有灵敏度高、快速、准确的特点，后逐渐应用于细菌耐药检测和耐药机制研究。MALDI-TOF MS技术主要是通过检测抗菌药物的修饰和水解情况来检测细菌耐药相关酶存在情况，或检测耐药株、敏感株指纹图谱的改变来判断耐药株和敏感株，从而达到检测细菌耐药性的目的^[10]。胡燕燕等^[11]利用MALDI-TOF MS建模检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药情况，该技术显示出极高的特异度和灵敏性，均达90%以上，在有纯培养细菌的情况下，0.5 h内就可获得准确的结果。该技术还可用于区分万古霉素耐药肠球菌与万古霉素敏感肠球菌^[12]、检测肠杆菌和铜绿假单胞菌碳青霉烯酶活性^[13]等。但是与传统药敏试验相比，MALDI-TOF MS技术只能区分敏感株和耐药株，无法获得准确的MIC值，且该技术判断耐药株和敏感株需要先利用已知敏感株和耐药株建模。目前，基于MALDI-TOF MS技术的检测方法在细菌耐药检测上的应用尚少，这是由于该技术设备和配套试剂昂贵、检测耐药种类有限，制约了其在临床和基层大范围推广应用，主要用于细菌耐药的科学研究领域。

2.3 基于基因检测的新技术

细菌产生耐药性的遗传基础是基因突变或获得耐药基因，通过针对性检测基因突变或相关耐药基因是细菌耐药性检测和监测的重要手段和途径。

2.3.1 单重PCR技术

PCR技术自发明后就广泛应用于包括医学、生物、农业、环境等各个领域^[1]。在细菌耐药基因检测中也发挥了巨大作用，包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌检测^[14-15]、结核分枝杆菌利福平耐药性检测^[16-17]、超级细菌的检测等，虽然细菌耐药表型是由多种因素共同决定的，其与耐药基因并非是完全的一一对应关系，但大量的研究显示，耐药基因的携带与细菌耐药表型是有对应关系的，如金属β-内酰胺酶基因bla_NDM，携带该基因的菌株对β-内酰胺类药物的耐药率达到95%以上。而且由于基因检测方法稳定、重复性好，是现今国内、外细菌耐药科研领域、监测领域使用最多的非培养耐药检测方法。

随着分子信标技术和PCR技术的发展^[1]，形成了一种新的技术——qPCR技术。利用该技术制造的商业化，qPCR仪已经在实验室、临床和基层疾控系统普遍推广。qPCR技术不仅实现了PCR从基因定性到定量的飞跃，而且与PCR技术相比，具有更高灵敏度和特异性、耗时短、自动化程度高，有效避免交叉污染，且可实时监控和分析实验进程及结果，无需进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析等优势。Francis等^[18]通过qPCR和药敏试验方法对323株院内来源的碳青霉烯酶阳性肠杆菌科细菌进行bla_KPC基因研究，结果显示：亚胺培南/美罗培南、厄他培南qPCR法与传统药敏检测结果对于判断是否携带bla_KPC基因与是否耐药的结果一致。在临床上，产碳青霉烯酶细菌对治疗、用药的及时性和准确性提出了更高的要求。因此，快速、准确判断细菌耐药情况是指导用药的关键，qPCR技术在快速诊断细菌耐药性中显示了强大的作用。

2.3.2 多重PCR技术

多重PCR技术是在反应体系中加入多对引物、探针进行PCR，扩增产物长度不同或具有不同发射光谱的荧光基团等，一次反应可以检测多个目的基因片段。随着抗菌药物使用范围的扩展和耐药机制研究的深入，越来越多的耐药基因被发现和研究，对细菌药物性检测提出了更高的要求，因此多重PCR技术及多重qPCR技术被引用到耐药研究和监测领域，这种快速、准确的技术可获得不止1种耐药性基因及元件信息，为耐药性研究提供了更加便利的方法。Nijhuis等^[19]2013年建立了一种可以直接从直肠拭子样本中检测出目前普遍流行于肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶基因bla_KPC、bla_OXA-48、bla_VIM和bla_NDM的qPCR新方法，不仅获得了与之前单重qPCR检测一致的结果，且可获得同时携带多重基因的情况(bla_NDM+OXA-181和bla_VIM+OXA-48)。van der Zee等^[20]建立了可同时检测bla_OXA-48、bla_VIM、bla_IMP、bla_NDM和bla_KPC基因的多重qPCR方法。Roschanski等^[21]建立的多重qPCR方法可检测多种产A类超广谱β-内酰胺酶基因，并且获得了极好的内、外部重复性和可信性。

2.3.3 基因芯片技术

基因芯片技术是一种基于杂交原理，能够同时将大量的探针固定于固相表面，核酸样本经荧光标记或扩增后，利用核酸杂交的特异性对大批量未知样品进行检测、分析的方法^[1]。1994年Pease等^[22]首先报道了基因芯片技术，证明了基因芯片技术在人类遗传学、病原体检测、DNA分子识别等领域不可忽视的作用。由于基因芯片技术高通量、高效、快速、准确的特点，不仅可以反映样本携带某种耐药基因的情况，还可以同时检测多种耐药基因的携带情况，同时避免了多重PCR技术多重反应相互影响、彼此制约、引物探针设计困难等问题，对包括未知病原体鉴定、疾病因子筛查、细菌耐药基因检测等方面具有重要意义。国内、外众多研究都显示了基因芯片技术在细菌耐药检测领域中的重大优势和潜在应用价值。

Perreten等^[23]开发了一种可以在1 h内同时检测革兰阳性菌中涉及超过6类抗菌药物多达90种耐药基因的基因芯片，通过对36株携带特定基因的革兰阳性菌进行验证，显示了该芯片极好的敏感度和特异性。2015年该团队对该芯片进行了优化，可以检测基因增加到117种，同时检测多种基因的能力也进一步提高，一次可检测金黄色葡萄球菌的15种耐药基因^[24]。在我国，基因芯片技术用于细菌耐药性检测、监测越来越受到重视，在包括结核分枝杆菌在内的耐药性研究应用日渐广泛。王金富等^[25]评价基因芯片在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值，与传统药敏试验相比，基因芯片的结果准确度均达90%以上，且将获得结果的时间缩短至4 d左右。舒丽红和丁显平^[26]对基因芯片方法检测耐异烟肼结核分枝杆菌准确性的Meta分析结果显示，与传统方法相比，基因芯片技术检测敏感度、特异性为82%和97%，显示了基因芯片在检测结核分枝杆菌耐药性中较好的应用价值。除此之外，基因芯片技术在其他多类耐药性检测上的应用也逐渐受到重视。韩龙等^[27]研发的基于医院病原菌谱、可同时检测10种病原菌和13种耐药基因的检测芯片，获得了与普通PCR相当的灵敏度。

基因芯片技术也存在局限性，如无法获得细菌精确的MIC值、设备和配套芯片价格昂贵，成品化芯片检查耐药基因固化与实际研究目的不一致，缺乏商品化的芯片自主研发耗时长、成本高等，这些都会制约该技术大规模推广应用。

2.3.4 全基因组测序技术

随着全基因组测序技术的发展，其在细菌耐药基因的确定和表型预测中得到了广泛的应用。Murugan等^[28]对1株血液中分离的铜绿假单胞菌(VRFPA09) 进行全基因组测序，分析结果显示其基因组携带aadA1、aph(3′)Ⅱb、sul1、catB7、tetG、dfrB5和fosA基因，且携带1个包含bla_Veb-1，bla_OXA-10，dfrB2，aacA7，aadA1基因盒的整合子，其中，aadA1、aph(3′)Ⅱb、aacA7等基因介导细菌对氨基糖苷类抗菌药物耐受；sul1、dfrB5、dfrB2基因介导细菌对磺胺类抗菌药物耐受；catB7基因介导细菌对氯霉素耐受；tetG基因介导细菌对四环素耐受；fosA基因介导细菌对磷霉素耐受；bla_Veb-1、bla_OXA-10基因介导细菌对青霉素、头孢菌素类抗生素的耐受。药物敏感性检测显示其对青霉素、头孢菌素类、氨基糖苷类、氯霉素类抗生素和美罗培南等药物耐药，药敏表型和耐药基因型完全吻合。Liu等^[29]通过全质粒测序和亚克隆发现首个可水平传递的多黏菌素耐药基因mcr-1，分析并推测了该基因所处基因环境及其传播策略。全基因组测序技术发挥其强大的细菌耐药基因搜索功能的前提是有完备的耐药基因数据库，该数据库应包含目前已知所有细菌耐药基因及元件，目前国际上公认的三大核酸数据库为：美国国家生物技术信息中心的GenBank、欧洲分子生物学实验室的EMBL和日本DNA数据库(DDBJ)，三大数据库每日交换、更新数据，保证数据库同步更新，但是目前国际上还缺乏着眼于细菌耐药基因的数据库。全基因组测序可以发现几乎所有细菌耐药相关基因和元件，在发现新的耐药基因/机制上有着其他技术无法比拟的优势，但是该法对耐药基因数据库的要求非常严格，且通过该方法进行耐药性检测过程繁琐、价格贵、通量低、分析耗时长，使得其更适用于重要细菌毒株的耐药机制的深入挖掘和研究工作。

2.3.5 基于qPCR的微流控芯片技术

集成流体通路技术与qPCR技术结合是检测细菌耐药性的一种新思路。集成流体通路技术是利用先进的集成工艺(光刻)在硅胶上刻上许多纳米级微管和纳米级微仓制成反应阵列，并通过独立的纳米级微型阀门控制溶液在阵列反应仓中的流动来实现样品的分液、混合、PCR扩增，该法大量的简化了生物样品和试剂的分液操作，实现了高通量、纳米级的反应体系，节约样本及体系成本。该法兼具基因芯片高通量的优势和qPCR灵敏度高、特异性强的特点^[30]。与多重PCR技术相比，它避免了多对引物探针之间相互干扰，实现了体系间物理分隔，单仓反应且通量更高；与基因芯片技术相比，集成流体通路技术无需提前将寡核苷酸固定于芯片上，可以实现待测样品与引物探针间的随意搭配组合，灵活性更高，目前在越来越多的检测、监测领域应用，但在细菌耐药基因检测领域应用尚为空白。Spurgeon等^[30]该将高通量新技术与传统qPCR技术进行对比，分别使用两种方法检测来自于18个不同成人/儿童的45个基因，结果显示新方法可一次性完成48×48重反应，且结果与传统qPCR方法一致，具有更好的内部重复性。Dhoubhadel等^[31]使用集成流体通路技术结合qPCR技术建立的高通量肺炎链球菌血清分型及定量方法，可检测50种血清型，可获得高于传统培养方法的样本阳性率和准确率。由上述研究我们可以看出，集成流体通路技术与qPCR技术结合的方法，可以在几个小时内同时完成高通量样本的几十种目的基因的检测，为细菌耐药基因、元件的快速、精准检测提供了新思路。

3 细菌耐药性检测方法比较

随着抗菌药物在人医、兽医领域的广泛应用，细菌耐药情况愈演愈烈，因而也对细菌耐药性检测手段提出了更高的要求。细菌药物敏感性实验是细菌耐药性检测最经典的方法，尤其稀释法是细菌耐药性检测的金标准，可获得精确的MIC值、灵活性强，是临床和实验室研究最为常用的细菌耐药性检测方法；商品化自动分析系统的推广应用，相比稀释法大大缩短了实验周期，特别适用于临床细菌耐药性检测。但无论是经典的稀释法亦或是自动分析系统，由于其均需要获得分离自样本的细菌纯培养物且耗时长，难以在抗感染治疗快速应对上发挥作用；随着检测技术的发展以及对细菌耐药性的更深入认识，更多的研究将目光投向与耐药基因产生和传播密切相关的耐药基因、元件的PCR及qPCR检测技术，这类技术可快速、准确地探知耐药基因、元件，从而及时确定感染细菌的药物敏感性，为临床抗感染治疗提供更加及时的依据，也逐渐成为临床和实验室耐药细菌检测、监测的重要手段，但该类技术只能用于已知目的基因的筛查，不能胜任大规模、高通量细菌耐药性的检测和监测工作。全基因组测序技术、MALDI-TOF MS以及微流控技术的发展为细菌耐药性检测提供了新思路。全基因组测序技术能够发现尽可能多的耐药机制，是细菌耐药机制研究的重要手段，但不适合临床和耐药性检测、监测中的推广应用；MALDI-TOF MS技术检测细菌耐药情况速度快、通量高，但由于其检测细菌耐药原理的限制，目前仅应用于有限几类细菌耐药性的检测；基因芯片技术尤其微流控技术快速、高通量、可同时检测多种耐药基因携带情况等特点，使其在细菌耐药性检测上具有光明的应用前景，但该方法也存在PCR技术的缺陷，且价格相对昂贵，为其在临床推广带来一定的困难，但该方法对于危重患者细菌耐药性广泛筛查有深远的现实意义。本研究将目前细菌耐药检测和研究领域使用和有潜在使用价值的多种检测方法从耗时、通量、准确性、操作灵活性等多个方面做比较，见表 1。

本文所述细菌耐药性检测方法都存在自身不可替代的优势和难以避免的劣势，难以笼统概括某种方法的优劣，各实验室和临床机构应根据自身需求选择相应的检测、监测方法，来应对愈来愈严峻的细菌耐药这一重大的公共卫生问题。

作者贡献:

车洁  ORCID：0000-0003-0473-7942

车洁：综述

陈霞、李娟、卢金星：校验陈霞、李娟、卢金星：校验