2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 郑皓, 李文革, 杨海英, 吴媛, 车洁, 陈小萍, 卢金星
- ZHENG Hao, LI Wen-ge, YANG Hai-ying, WU Yuan, CHE Jie, CHEN Xiao-ping, LU Jin-xing
- 脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立
- Establishment of a multiplex RT-PCR assay for common pathogens causing sepsis
- 疾病监测, 2017, 32(9): 752-756
- Disease Surveillance, 2017, 32(9): 752-756
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.09.012
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文章历史
- 收稿日期：2017-01-11
2. 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司, 北京 102206
2. Beijing Applied Biological Technologies Co., Ltd. Beijing 102206, China
脓毒症(sepsis)是由感染导致的全身炎症反应综合征(SIRS)，是严重烧伤、多发伤、外科手术后等临床危急重症患者的严重并发症之一，易发展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(MODS)，死亡率达28.3%~41.1%[1]，是导致重症监护病房(ICU)患者死亡的主要原因之一[2-3]。早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善脓毒症预后的关键[4]。目前临床诊断脓毒症病原体的标准方法是血培养加生化鉴定，但此方法所需时间长(约需41.5~48.0 h)，很难指导临床用药，从而耽误病情。研究表明[5-7]，目前我国脓毒症病原菌以金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、粘质沙雷菌和阴沟肠杆菌多见。另外，真菌发病率呈升高趋势，以白假丝酵母菌多见。本研究采用多重实时PCR技术，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌作为目标病原菌，旨在建立一种快速、方便、灵敏、特异的检测方法，从而指导临床及时正确治疗。
1 材料与方法 1.1 菌株及标本来源肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1706)、大肠埃希菌(ATCC8099)、铜绿假单胞菌(ATCC15442)、鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923) 和白假丝酵母菌(ATCC18804) 购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。含各试验菌种靶基因片段的质粒由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所医院感染室保存。收集的临床菌株(热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、粪肠球菌、屎肠球菌、军团菌、曲霉菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肺炎链球菌、伤口埃希菌、鼻疽假单胞菌、荧光假单胞属、醋酸钙不动杆菌和溶血不动杆菌各1株)由中国CDC传染病预防控制所医院感染室保存。收集2013年8月至2015年2月北京复兴医院临床诊断为脓毒症患者的血培养阳性标本共112份。
1.2 主要仪器和试剂ABI PRISM 7500多通道RT-PCR仪，Sensoquest LabCycler普通PCR仪，NanoDrop ND-2000超微量分光光度计。OMEGA Bacterial DNA Kit细菌核酸提取试剂盒，OMEGA Yeast DNA Kit酵母菌核酸提取试剂盒(Omega BioTek，美国)。
1.3 试验方法 1.3.1 反应模板的制备菌种DNA模板制备：冻存的细菌菌株接种于哥伦比亚血平皿，37 ℃，培养过夜，挑单克隆用BHI(Brain Heart Infusion)增菌培养，37 ℃，200 r/min，培养24 h；冻存的真菌菌株接种于YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)琼脂平皿，25 ℃，培养48 h，挑单克隆于YPD培养液中，25 ℃，200 r/min，培养24 h。分别按照OMEGA Bacterial DNA Kit细菌核酸提取试剂盒和OMEGA Yeast DNA Kit酵母菌核酸提取试剂盒说明书提取病原菌的DNA，并冻存于-80 ℃备用。
临床血培养阳性标本DNA模板制备：抽取100 μl血培养液，细菌血培养液接种于哥伦比亚血平皿，37 ℃，培养24 h；真菌血培养液接种于YPD琼脂平皿，25 ℃，培养48 h。分别按照OMEGA Bacterial DNA Kit细菌核酸提取试剂盒和OMEGA Yeast DNA Kit酵母菌核酸提取试剂盒说明书提取病原菌的DNA，并冻存于-80 ℃备用。
1.3.2 引物、探针设计合成从GenBank数据库中查找肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的基因组序列，分别进行序列比对。根据上述病原菌的基因序列保守区分别设计引物和探针，要求引物、探针之间不能形成局部配对的可能，同时利用GenBank数据库进行BLAST特异性验证，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目标基因和引物、探针序列见表 1。
| 病原菌 | 目标基因 | 引物和探针 | 序列(5′~3′) |
| 金黄色葡萄球菌 | NUC | SAF | CAT CAC AAA CAG ATA ACG G |
| SAR | AAT TAA TGT CGC AGG TTC | ||
| SAP | AAG TTG CAC TAT ATA CTG TTG GAT CTT CAG | ||
| 铜绿假单胞菌 | rpod | PAF | TCA ACC TGA AGG ACG ATT |
| PAR | CCT TCT TGG CCT TGT CGA G | ||
| PAP | CTG TCG CTG CTG TCG TCG CTT | ||
| 鲍曼不动杆菌 | recA | BAF | GTT TAT CAA GAT TTA GCT CGT CGT |
| BAR | TTA AAG GAC CCA CTA GCC A | ||
| BAP | TTG CCA TAA CCA ACA CGC TTC ACT | ||
| 肺炎克雷伯菌 | khe | KPF | AGG CCA ATA AGA AGT ACA ACC |
| KPR | TCA ACC CAA CGA TCC TG | ||
| KPP | AGA AGT ACA ACC GCA TTT ATT ACC CGC TC | ||
| 白假丝酵母菌 | ITS1 | CAF | AAT ACG ACT TGG GTT TGC TTG A |
| CAR | TTA GAC CTA AGC CAT TGT CA | ||
| CAP | TCC CGC CTT ACC ACT ACC GTC | ||
| 大肠埃希菌 | uidA | ECOF | TGT ACA GTT CTT TCG GCT TGT TG |
| ECOR | GCT GTC GGC TTT AAC CTC T | ||
| ECOP | CCC GCT TCG AAA CCA ATG CCT | ||
| 凝固酶阴性葡萄球菌 | rpoB | CNSF | TAT CCA CGA AAC TTC TAA AAC AAC TGT TAC T |
| CNSR | TCT TTA GAT AAT ACG TAT ACT TCA GCT TTG AAT TT | ||
| CNSP | TAT TAG ACT ACG CTG AAG CTG GTG ACA ACA T |
将检测的目标病原菌分为两组，分别记为A管、B管。A管进行四重扩增，包括铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌；B管进行三重扩增，包括鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌和白假丝酵母菌。按上述分组进行多重实时PCR的优化，通过多次试验，首先确定了变化较小的因素：10×Taq buffer、dNTPs、Taqman enzyme(购自美国BD公司，Becton，Dickinson and Company)和45个循环，摸索最适模板浓度后固定，对影响较大的因素(退火温度、延伸时间和镁离子浓度)进行优化。加入等浓度的引物，优化退火温度和延伸时间，在扩增效果最佳的条件下，根据各条带的模糊程度及亮度差别，调整各个引物的浓度。最后，通过调整镁离子浓度，得到最优的多重实时PCR检测体系。最终反应体系见表 2。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃复性延伸45 s(收集荧光，循环45次)。设立含各细菌靶基因片段质粒为阳性对照，无菌DEPC水为阴性对照。
| 组分 | 终浓度/体积 |
| 10×Taqbuffer | 1× |
| MgCL2 | 5 mmol/L |
| dNTP | 0.4 mmol/L |
| Taqman enzyme | 0.1 U/μl |
| 上游引物 | PAF 300 nmol/L，SAF 400 nmol/L，ECOF 400 nmol/L，KPF 300 nmol/L，BAF 200 nmol/L，CNSF 200 nmol/L，CAF 150 nmol/L |
| 下游引物 | PAR 300 nmol/L，SAR 400 nmol/L，ECOR 400 nmol/L，KPR 300 nmol/L，BAR 200 nmol/L，CNSR 200 nmol/L，CAR 150 nmol/L |
| 探针 | PAP 300 nmol/L，SAP 400 nmol/L，ECOP 400 nmol/L，KPP 300 nmol/L，BAP 200 nmol/L，CNSP 200 nmol/L，CAP 150 nmol/L |
| DNA模板 | 2 μl |
| 总体积 | 加DEPC水至25 μl |
按照1.3.3反应体系检测热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、粪肠球菌、屎肠球菌、军团菌、曲霉菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肺炎链球菌、伤口埃希菌、鼻疽假单胞菌、荧光假单胞菌属、醋酸钙不动杆菌和溶血不动杆菌各1株。
1.3.5 多重实时PCR敏感性实验A、B管均用嗜麦芽窄食单胞菌和光滑假丝酵母菌的DNA作为干扰进行多重实时PCR敏感性实验。将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和光滑假丝酵母菌的DNA等量混合作为A管模板，将鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、白假丝酵母菌、嗜麦芽窄食单胞菌和光滑假丝酵母菌的DNA等量混合作为B管模板，按照1.3.3反应体系进行多重实时PCR检测。
1.3.6 多重实时PCR灵敏度实验肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌提取的DNA模板用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计定量后，进行10倍梯度系列稀释，共5个浓度梯度，记为1×10-1，1×10-2……1×10-5，进行多重实时PCR检测，每个梯度重复10次。按照1.3.3反应体系进行多重实时PCR扩增，利用含各试验菌种靶基因片段的质粒作对比参考，>95%阳性检出率的稀释度作为最低检出限，确定其灵敏度。
1.3.7 多重实时PCR的应用将112份临床血培养标本提取的DNA作为模板进行病原菌通用引物16S rDNA(细菌)或ITS1/ITS4(真菌)基因PCR扩增，查阅文献[8-10]，引物序列见表 3，PCR产物送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序。同时，用本方法对临床收集的112份脓毒症血培养阳性标本进行验证。
| 病原菌 | 目标基因 | 引物序列(5′~3′) | 扩增长度(bp) | 退火温度(℃) |
| 细菌 | 16S rDNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG R: GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | 500 | 58 |
| 真菌 | ITS1/ITS4 | F: TCC GTA GGT GAA CCT GCG G R: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC | 541 | 55 |
建立的多重实时PCR检测方法对热带念珠菌、光滑假丝酵母菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、粪肠球菌、屎肠球菌、军团菌、曲霉菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肺炎链球菌、伤口埃希菌、鼻疽假单胞菌、荧光假单胞菌属、醋酸钙不动杆菌、溶血不动杆菌等病原菌均无扩增，具有良好的特异性。
2.2 多重实时PCR敏感性建立的多重实时PCR检测方法对肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有良好扩增。设计的引物和探针均只能扩增与其对应的病原菌DNA，不受其他病原菌DNA的干扰，具有良好的敏感性。
2.3 多重实时PCR灵敏度经测定，实验病原菌浓度均为1 ng/μl，梯度稀释检测结果表明，当1×10-5梯度时，均表现为阳性且重复性良好，此多重实时PCR方法的A、B两管灵敏度均可达10-5ng/μl(Ct值均约35)。
2.4 多重实时PCR的应用112例临床血培养阳性标本的16S rDNA或ITS1/ITS4基因测序结果显示，83例在目标病原菌范围内，占总标本量的74.11%(83/112)，29例在目标病原菌范围外。针对112例临床血培养阳性标本进行多重实时PCR检测，83例目标病原菌检出80例阳性(包括肺炎克雷伯菌8例、大肠埃希菌12例、铜绿假单胞菌10例、鲍曼不动杆菌5例、凝固酶阴性葡萄球菌30例、金黄色葡萄球菌12例、白色念珠菌3例)，检测结果与基因测序结果一致；29例非目标病原菌(包括粪肠球菌5例、屎肠球菌4例、粘质沙雷菌4例、阴沟肠杆菌5例、嗜麦芽窄食单胞菌3例、霍氏肠杆菌3例、近平滑假丝酵母菌3例、热带念珠菌2例)，检测结果均为阴性。敏感性为96.39%(80/83)，特异性为100%(29/29)。
3 讨论现代医学对脓毒症的认知和诊疗水平不断提高，但其发病率和病死率仍居高不下[5,11]。目前临床标准检测方法是血培养加生化鉴定，耗时长(41.5~48.0 h)，阳性率低(约30%[12-13]，我国仅17%[14])。为缩短时间和提高灵敏度，发展出的新方法主要分两大类，一类是在血培养阳性基础上，通过核酸扩增或杂交的方法检测；另一类是用PCR方法直接检测病原体。后者虽然更快速，但灵敏度低(60%~87%)，低于血培养的方法(80%~98.8%)，因此目前更倾向发展血培养加核酸扩增的方法[15]。常规PCR不能短时间完成大批量样品多指标检测，且易造成交叉污染[16-17]。多重实时PCR可同时对多种病原体检测，具有快速、灵敏、特异、高通量等优点。本研究旨在建立血培养加多重实时PCR对脓毒症常见病原菌的检测方法。
本研究成功建立了肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR检测方法，对其他病原菌无扩增，对以上目标病原菌有特异性扩增，灵敏度达10-5 ng/μl。112份血标本检测结果显示，本方法特异性达100%，敏感性达96.39%，具有快速、高效、特异、敏感的特点。然而，该方法没有覆盖屎肠球菌、粪肠球菌等临床常见病原菌，主要是受优化条件限制，以上病原菌还不能达到理想检测效果。一个比较可行的办法是根据不同地区、不同时间的病原菌谱不同，调整多重实时PCR系统，尽可能将主要病原菌包含在内。此外，多重实时PCR和生化鉴定可同时分析血培养阳性样本，在生化鉴定结果出来前，多重实时PCR能鉴定或排除主要病原菌，提高检测能力，缩短时间，对临床早诊断、早治疗和降低病死率有重要意义。
作者贡献:
郑皓 ORCID：0000-0002-6529-1457
郑皓：撰写文章，病原菌接种、培养，多重实时PCR实验
李文革：病原菌接种、培养、保藏
杨海英：多重实时PCR实验
车洁：多重实时PCR实验
吴媛：文章修改、润色
陈小萍：文章修改、润色
卢金星：研究设计，撰写修改文章
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