疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (8): 678-682

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刘祥, 张玲, 李新琼, 闫国栋, 邹年莉, 张正东, 李群, 熊衍文, 王红
LIU Xiang, ZHANG Ling, LI Xin-qiong, YAN Guo-dong, ZOU Nian-li, ZHANG Zheng-dong, LI Qun, XIONG Yan-wen, WANG Hong
艾伯特埃希菌快速鉴定方法比较研究
Comparative study on rapid identification methods for Escherichia albertii
疾病监测, 2017, 32(8): 678-682
Disease Surveillance, 2017, 32(8): 678-682
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.08.016

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收稿日期:2017-03-13
艾伯特埃希菌快速鉴定方法比较研究
刘祥1, 张玲1, 李新琼1, 闫国栋1, 邹年莉1, 张正东1, 李群1, 熊衍文2, 王红1     
1. 四川省自贡市疾病预防控制中心, 四川 自贡 643000;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室 北京 102206
摘要目的 评价目前用于快速鉴定艾伯特埃希菌方法的特异性。方法 利用51株艾伯特埃希菌及其他对照菌株,分别评价基于clpXlysPmdh基因的三重聚合酶链式反应(PCR);基于EA 0134基因的单重PCR;基于EACBF 2103-EACBF2104基因的巢式PCR。结果 51株艾伯特埃希菌三重PCR均为阳性,鉴定吻合率为100%;巢式PCR两轮结果均为阳性,鉴定吻合率为100%,对照组第1轮PCR结果全部为阴性,但第2轮出现非特异条带。51株中49株EA 0134基因为阳性,鉴定吻合率为96.08%,对照菌株中伤寒沙门菌和肠出血性大肠埃希菌O157:H7扩增出大小类似的片段。结论 EA 0134基因在一些菌株中缺失,会造成漏判,同时在部分肠道菌株中存在非特异性扩增,会造成误判。三重PCR和巢式PCR的第1轮扩增均具有高特异性,可作为目前艾伯特埃希菌分离株的PCR快速鉴定方法,为艾伯特埃希菌相关的临床诊断和突发公共卫生事件处置,提供准确快速的诊断依据。
关键词艾伯特埃希菌    快速鉴定    特异性评价    
Comparative study on rapid identification methods for Escherichia albertii
LIU Xiang1, ZHANG Ling1, LI Xin-qiong1, YAN Guo-dong1, ZOU Nian-li1, ZHANG Zheng-dong1, LI Qun1, XIONG Yan-wen2, WANG Hong1     
1. Zigong Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Zigong 643000, Sichuan, China;
2. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
This study were supported by the fund for Zigong Key Science and Technology Program (No.2013S06), Project of Health and Family Planning Commission of Sichuan Province(No.150259) and the Open Project of State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control (No.2016SKLID309)
Corresponding author: WANG Hong, E-mail:460973389@qq.com.
Abstract: Objective To understand the specificity of the rapid identification methods for Escherichia albertii. Methods Fifty-one E. albertii strains and other control strains were used to evaluate the specificities of multiplex-PCR based on clpX, lysP and mdh genes, PCR based on EA 0134 gene and nested PCR based on EACBF 2103 -EACBF 2104 gene. Amplification sequences were used for analysis and compare after sequencing. Results All of 51 strains of E. albertii were positive in multiplex-PCR, the identification rate was 100%.The results of 2 round nested PCR were all positive, the identification rate was 100%, and the first round nested PCR results in the control group were all negative, but non-specific band appeared in the second round. In the 51 strains, 49 were positive for EA 0134 gene, the identification rate was 96.08%, and similar fragments were amplified from Salmonella typhi and Escherichia coli O157:H7 in the control strains. Conclusion The deletion of EA 0134 gene in some strains might lead to misdiagnosis. The multiplex-PCR and 1st round nested PCR were highly specific, which can be used as the main method for the rapid identification of suspected E. albertii strains, clinical diagnosis of E. albertii infection and response of related public health emergency.
Key words: Escherichia albertii     Rapid identification     Specificity evaluation    

艾伯特埃希菌(Escherichia albertii)最初是从孟加拉达卡腹泻儿童粪便标本中分离,被鉴定为蜂房哈夫尼亚菌[1-3]。随着生化鉴定系统和毒力基因检测技术的发展,艾伯特埃希菌被归类为携带eae基因的肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)或肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC),直到分子分型和聚类分析技术的广泛应用,最终将艾伯特埃希菌准确地定义为埃希菌属中的一个新种[3]

2004年,美国阿拉斯加出现了一起大规模金翅鸟雀死亡暴发,从中分离到艾伯特埃希菌,推测该菌可能是引起此次暴发的致病菌[4]。2011年11月,日本秋田县出现一起22例胃肠炎病例暴发,从中分离到艾伯特埃希菌[5]。据报道[6-7],艾伯特埃希菌可能是美国不明原因引起的食源性疾病(6 200万例)及死亡(3 200例)的原因之一。国际社会逐步认识到该菌可能对人类公共卫生构成的威胁。鉴于我国不明原因感染性腹泻发病率高,是否与艾伯特埃希菌致感染性腹泻相关,自贡市疾病预防控制中心(CDC)在国内率先开展了相关病原学研究[8]

艾伯特埃希菌缺乏区分于大肠埃希菌的特异性生化特征,目前主要采用多位点序列分型(MLST),16S rDNA测序等分子生物学方法[8-11],通过构建系统进化树分析是否为该菌,这对人员和设备有较高要求。Hyma等[12]依据大肠埃希菌、志贺菌、艾伯特埃希菌共有的clpX基因,以及艾伯特埃希菌管家基因lysPmdh建立的三重PCR体系,作为一种基因检测方法,在艾伯特埃希菌的鉴定中起到重要作用。2014年Maeda等[13]基于艾伯特埃希菌参考菌株(TW07627) 特有序列,设计用于扩增EA0134的引物来检测和鉴定艾伯特埃希菌。Ooka等[14]于2015年根据艾伯特埃希菌特有的保守序列设计的巢式PCR方法(Eal-OF/Eal-OREal-NF/Eal-NR)也用于检测鉴定艾伯特埃希菌。本研究利用51株eae阳性、不发酵乳糖的艾伯特埃希菌,评价3种PCR方法的特异性,推荐可用于艾伯特埃希菌快速鉴定的方法。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

实验组菌株为51株艾伯特埃希菌,于2014-2016年分离自四川省自贡地区食品、动物粪便、腹泻患者粪便等样本,1株购自日本的艾伯特埃希菌参考菌株LMG20976,作为PCR实验阳性对照菌株。试验用艾伯特埃希菌均为eae阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性。

同时设立对照组菌株共40株:大肠埃希菌6株、弗氏枸橼酸杆菌3株、肺炎克雷伯菌1株、甲型副伤寒沙门菌1株、伤寒沙门菌1株、猪霍乱沙门菌1株、类志贺邻单胞菌1株、普通变形杆菌2株、奇异变形杆菌3株、肠炎沙门菌1株、产气肠杆菌1株、黏质沙雷菌1株、粪肠球菌4株、单增李斯特菌3株、摩氏摩根菌1株、副溶血性弧菌1株、阴沟肠杆菌1株、铜绿假单胞菌1株、鲍曼不动杆菌1株、小肠结肠炎耶尔森菌4株、福氏志贺菌2株,均由中国CDC传染病预防控制所提供。

1.2 主要仪器与试剂 1.2.1 主要仪器

Labcycler PCR仪购自德国SensoQuest公司,KTP-250B电热恒温恒湿培养箱购自上海齐欣科学仪器有限公司,GEL DocXR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司,TV-100恒温金属浴购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂

营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司;2×Taq MasterMix、DNA Marker(DM1000)、去离子水:购自北京康为世纪生物科技有限公司;核酸染料(GeneGreen)购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物合成及测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.3 DNA模板制备

各接种一环实验菌株冻存液于营养琼脂平板,36 ℃培养18 h。用一次性无菌接种环刮取少量纯培养物于含有1 ml去离子水的EP管中,充分混匀后于金属浴中100 ℃煮沸10 min,再将重悬液10 000 r/min离心5 min,取上清液作为PCR模板。

1.4 三重PCR检测

采用clpXlysPmdh建立的三重PCR检测方法,对实验菌株和对照菌株进行检测,引物见表 1。反应条件:预变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 30 s,退火58 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,35次循环,最后72 ℃总延伸5 min。PCR反应体系:在50 μl体系中,2×Taq MasterMix 25 μl,10 μmol/L上、下游引物各2 μl,DNA模板1 μl,去离子水12 μl。每次扩增均设有阴、阳性对照。

表 1 三重特异性PCR引物 Table 1 Primers for multiplex-PCR
基因
名称
引物序列(5′~3′)产物大小
(bp)
clpXF: TGG CGT CGA GTT GGG CA384
R: TCC TGC TGC GGA TGT TTA CG
lysPF: GGG CGC TGC TTT CAT ATA TTC TT252
R: TCC AGA TCC AAC CGG GAG TAT CAG GA
mdhF: CTG GAA GGC GCA GAT GTG GTA CTG ATT114
R: CTT GCT GAA CCA GAT TCT TCA CAA TAC CG
1.5 EA0134基因检测

采用Maeda设计引物序列EA0134-283F(5′-TTG CGT ACT AAC GCA GGA TG-3′),EA0134-446R (5′-TGT GAC TGT TGG GCT ATT GG-3′),对实验菌株和对照菌株进行检测。目的片段大小为209 bp。反应条件:预变性95 ℃ 2 min,变性94 ℃ 30 s,退火58 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,35次循环,最后72 ℃总延伸5 min。PCR反应体系:在20 μl体系中,2×Taq MasterMix 10 μl,10 μmol/L上、下游引物各1 μl,DNA模板1 μl,去离子水7 μl。每次扩增均设有阴、阳性对照。

1.6 巢式PCR检测

采用巢式PCR方法对实验菌株和对照菌株进行检测,引物见表 2。第1轮使用引物Eal-OF/Eal-OR,第2轮使用引物Eal-NF/Eal-NR。反应条件:预变性96 ℃ 5 min,变性96 ℃ 30 s,退火54/60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,30次循环,最后72 ℃总延伸5 min。PCR反应体系:在20 μl体系中,2×Taq MasterMix 10 μl,10 μmol/L上、下游引物各1 μl,DNA模板1 μl,去离子水7 μl。每次扩增均设有阴、阳性对照。

表 2 巢式PCR引物 Table 2 Primers for nested PCR
PCR
反应
引物序列(5′~3′)退火温度
(℃)
产物大小
(bp)
第1轮Eal-OF: GGT CCA TAA TGA ATC TGA CTG A
Eal-OR: CCA TAT GAC AGG CGT AAT TGA T
54846
第2轮
Eal-NF: CAG TCG ATG GTT TCA CCT GA
Eal-NR: ACA CCG TGG CGA AAT GGC A
60731
1.7 结果观察与分析

取PCR产物5 μl以1.5%琼脂糖凝胶(含万分之一核酸染料)进行电泳,通过BIO-RAD凝胶成像系统观察是否扩增出目的大小片段,必要时将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

2 结果 2.1 三重PCR检测

51株艾伯特埃希菌三重PCR检测结果均为阳性,对照菌株3个基因检测结果不全为阳性,其中87号伤寒沙门菌虽扩增3条产物,但与阳性对照产物大小不一致,见图 1

图 1 三重PCR(clpX、lysP、mdh)检测结果 Figure 1 Detection result of multiplex-PCR 注:M:Marker,+:阳性对照(艾伯特埃希菌LMG20976),-:阴性对照;1~51:艾伯特埃希菌实验菌株;52~91:对照菌株
2.2 EA0134检测

51株艾伯特埃希菌中12号和41号泳道的2株实验组菌株检测为阴性,而其余艾伯特埃希菌为阳性。在对照组中86号泳道伤寒沙门菌和89号泳道大肠埃希菌O157:H7 (EDL933) 检测到大小类似的条带,见图 2

图 2 EA0134基因检测结果 Figure 2 Detection result of EA0134 gene 注:M:Marker,+:阳性对照(艾伯特埃希菌LMG20976),-:阴性对照;1~51:艾伯特埃希菌实验菌株;52~91:对照菌株

将49份阳性样品产物以及伤寒沙门菌和大肠埃希菌O157:H7 (EDL933) 扩增产物送至生工生物工程(上海)有限公司TA克隆后测序。经BLAST比对,产物序列一致且长度均为212 bp,与GenBank数据库中艾伯特埃希菌KF1(CP007025) 高度同源(相似性为99%)。

伤寒沙门菌扩增产物为197 bp,与Salmonella enterica strain C629全基因组中的174 bp序列匹配(CP015724.1:2494449 to 2494622),其5′端与EAO134下游引物序列相同,3′端与EAO134上游引物序列反向互补。大肠埃希菌O157:H7 (EDL933) 扩增产物为210 bp,与Escherichia coli O157:H7 str.EDL933全基因组中的201 bp匹配(CP008957.1:2584599 to 2584798),其5′端与EAO134上游引物序列相同,3′端与EAO134下游引物序列反向互补,见图 3

图 3 PCR产物序列与EA0134引物比对结果 Figure 3 Comparison of PCR product sequences and primers for EA0134 gene
2.3 巢式PCR检测

51株艾伯特埃希菌2轮巢式PCR产物均为阳性。对照菌株第1轮结果为阴性,但大多数第2轮巢式PCR扩增结果存在较多非特异条带。

3 讨论

本研究利用已通过MLST、16S rDNA测序分析鉴定为艾伯特埃希菌的51株菌,比较3种鉴定艾伯特埃希菌PCR方法的特异性。实验结果显示51株艾伯特埃希菌三重PCR结果均为阳性,对照组中3个基因不全为阳性,鉴定吻合率达100%。巢式PCR依据2轮扩增结果进行判断,结果显示51株菌均显示为阳性,鉴定吻合率达100%。而EA0134实验结果显示有49株艾伯特埃希菌为阳性,鉴定吻合率为96.08%,对照组中伤寒沙门菌、大肠埃希菌O157:H7 (EDL933) 在相同位置出现条带,为验证条带是由引物扩增产生而非模板污染导致,将49株艾伯特埃希菌阳性产物和沙门菌、大肠埃希菌O157:H7(EDL933) 的产物TA克隆测序。PCR产物序列BLAST时发现,49株艾伯特埃希菌均比对为艾伯特埃希菌KF1全基因组部分片段,伤寒沙门菌比对为Salmonella enterica strain C629,大肠埃希菌O157:H7 (EDL933) 比对为Escherichia coli O157:H7 str.EDL933,同时所有PCR产物5′和3′端序列与引物完全匹配,表明EA0134均能在艾伯特埃希菌、伤寒沙门菌和大肠埃希菌O157:H7中扩增出大小相似的片段,容易造成误判。

综上所述,EA0134引物特异性不高,会造成漏判和误判。三重PCR(clpXlysPmdh)和巢式PCR(Eal-OF/Eal-OR)第1轮具有高度特异性,2种方法均可作为快速鉴定艾伯特埃希菌的方法。

作者贡献:

刘祥  ORCID:0000-0003-0842-6228

刘祥:主要完成本研究的实验设计、实施,艾伯特埃希菌的分离与鉴定,分子生物学实验及测序数据分析

张玲、李新琼、闫国栋、邹年莉:协助完成菌株模板制备,PCR扩增及电泳检测

张正东、李群、熊衍文、王红:给予本研究设计和技术指导

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