随着抗菌药物的广泛使用，耐药性细菌的出现成为全球不容忽视的严重问题，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是目前世界范围内人医和兽医临床上的常见病原菌^[1-3]。自1961年英国首次发现MRSA之后，便以惊人的速度在世界各地蔓延。近年来，MRSA的临床分离率呈明显上升趋势，并且对各种常用抗生素耐药，给临床治疗带来了严峻挑战，因此受到了全球广泛关注和重视^[4-6]。Devriese等^[7]报道在患乳腺炎的奶牛奶汁中检出MRSA以后，许多不同种动物如犬、猫、马、羊、猪、牛及家禽中均检出MRSA。有证据表明农场中家畜和人携带的MRSA存在交叉传播，且养殖猪、牛等的农场中MRSA的分离率高于养鸡场^[8-9]。本研究对安徽省MRSA在动物食品、动物临床及人医临床中的分布和流行情况进行分析，对其耐药情况进行研究，旨在为控制MRSA的感染和临床用药提供理论支持。

质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213和粪肠球菌ATCC29212，购自中国食品药品检定研究院。食源、动物源和人源菌株于2012年3-12月期间，分别采集于安徽省淮北、合肥和马鞍山地区的农贸市场、屠宰场，奶牛场及三甲医院。每个市选取10家农贸市场，每个农贸市场采集15份标本。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪器购自美国BIO-RAD公司；VITEK-32微生物分析仪及配套比浊仪购自法国生物梅里埃公司；DYY-10C型电泳仪购自北京六一仪器厂；CHEF-MAPPER脉冲场电泳仪及Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司。GPI鉴定卡和GPS药敏卡由法国生物梅里埃公司生产；头孢西丁纸片(FOX 30 μg)购自Oxoid公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、上样缓冲液及DNA Marker DL2000购于大连宝生物公司；琼脂糖购自上海东海制药厂；MH琼脂购自杭州天和微生物试剂厂。

动物性食品标本的采集：分别采集淮北、合肥和马鞍山地区农贸市场的家畜及家禽肉类25 g。盛放于无菌试管或容器中，具体分离培养参照GB 4789.10-2010进行。动物临床标本的采集：采集合肥市某屠宰场刚宰杀的猪鼻腔拭子60份，快速放入装有2 ml 7.5% NaCl肉汤的5 ml试管中，封口摇匀，做好标记。标本接种于羊血琼脂平板上，35 ℃孵育培养18~24 h。人医临床标本的采集：采用常规方法采集门诊和住院患者的标本，主要是其炎性组织液或带血的脓性分泌物。标本接种于羊血琼脂平板上，35 ℃孵育培养18~24 h。

所有MRSA菌株按细菌鉴定程序，采用法国生物梅里埃公司的VITEK-32全自动微生物分析系统的GPI卡进行鉴定，鉴定为金黄色葡萄球菌，同时进行补充试验，包括革兰染色、触酶试验、血浆凝固酶试验，所有MRSA菌株均为阳性。应用临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的头孢西丁纸片扩散法进行筛选。抑菌圈≤19 mm为耐药，≥20 mm为敏感。抑菌圈内有任何小菌落生长都应判断为MRSA。

用PCR方法检测mecA基因进行确认。引物序列和扩增条件参照文献[10]进行。引物由上海生物工程公司合成。模板的提取采用煮沸方法，PCR反应体系25 μl，其中Taq酶0.2 μl、10×Buffer缓冲液2.5 μl、dNTP 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、模板1 μl，无菌双蒸馏水补足25 μl；热循环参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环30次，最后72 ℃延伸5 min；电泳并在紫外凝胶成像仪下观察及记录结果。

采用VITEK-32微生物分析仪GPS109药敏板对82株MRSA进行检测，共检测MRSA对14种抗菌药物的耐药性。14种抗菌药物分别为万古霉素、利奈唑烷、利福平、喹努普汀/达福普汀、四环素、甲氧苄啶/磺胺异恶唑、头孢唑啉、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄西林、氯洁霉素、红霉素、苯唑西林和青霉素G。操作过程严格依照说明书进行。

参照美国CDC的PulseNet实验手册^[11]。从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于2 ml细胞悬浮液(cell suspension buffer, CSB)中，浊度仪调节其麦氏浊度值为4.0，取400 μl CSB 37 ℃孵育5 min后加入20 μl蛋白酶K混匀。将菌悬液与400 μl 1% Seakem Gold:1%SDS慢慢混匀后加入模具，避免产生气泡，室温下凝固10~15 min后制成胶块。将胶块移入装有5 ml细胞裂解液(cell lysis solution, CLB)中，54 ℃水浴摇床(转速约130 r/min)中孵育2 h。弃去CLB后加入50 ℃预热的纯水，于50 ℃水浴摇床中清洗2次。每次10 min，然后用TE清洗4次，重复以上步骤，每次15 min。切取2 mm宽的胶块放入150 μl Sma Ⅰ酶切缓冲液中37 ℃缓冲10~15 min。吸出缓冲液，加入酶切液，每个菌株用酶40 U，H9812使用Xba Ⅰ酶切。确保胶块在液面下，37 ℃至少孵育2 h。吸出酶切液，每管加入200 μl 0.5×TBE，将胶块黏在梳子齿上，室温静置5 min后，用100 ml 1%金胶琼脂糖(Seakem Gold Agarose, SKG)将胶条浸润，室温凝固30 min后电泳。电泳条件为0.5×TBE，电压6.0 V/cm，120 °夹角，脉冲切换时间为2~50 s，时间22 h。电泳结束后，将胶块放入1 μg /ml EB中，染色300 min，然后用纯水脱色60 min，读胶仪中观察拍照。

分别从安徽省淮北、合肥和马鞍山地区采集人医临床标本、动物源性食品标本、猪鼻腔拭子和养牛场奶牛乳液标本。经分离培养和鉴定，MRSA的检出结果见表 1。

经头孢西丁纸片扩散法筛选到82株MRSA，对其进行mecA基因检测，凝胶成像系统观察310 bp处出现荧光条带，82株MRSA均携带mecA基因。部分PCR结果扩增电泳见图 1。

图 1 部分菌株mecA基因PCR扩增产物电泳结果 Figure 1 Electrophoretogram of mecA PCR products of some MRSA isolates

图选项

所有菌株对青霉素G、氨苄西林100%耐药，对红霉素、苯唑西林、头孢唑啉、克林霉素、庆大霉素及左氧氟沙星的耐药率较高，对甲氧苄啶/磺胺异恶唑、利福平、四环素的耐药率较低，对万古霉素、奎努普丁/达福普丁和利奈唑胺均100%敏感。82株菌株药敏实验结果见表 2。

82株不同来源的MRSA经Sma Ⅰ酶切，PFGE电泳，所得图像经BioNumerics 5.0软件进行聚类分析，应用非加权平均法(UPGMA)，聚类相似性系数采用基于条带比较的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的条带个数，M表示所有的条带个数(2株菌带型上的条带数总和减去匹配的条带数)。结果见图 2，不同来源株MASA经PFGE分型可分为49个型别，不同来源MRSA的PFGE型别各不相同，同源性较低。

图 2 安徽省82株不同来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PFGE-SmaⅠ酶切结果 Figure 2 PFGE patterns digested by SmaⅠ of 82 MRSA strains with different sources in Anhui

图选项

MRSA自1961年初次发现以来，随着时间的推移，其感染几乎遍及世界各地的各级医院和临床各注：M：DL2000 DNA Marker，1：人医临床分离株；2：动物食品标本分离株；3~5：动物临床标本分离株；6：ATCC259237(阴性对照)；7：ATCC43300(阳性对照)科室，在我国也呈逐年增多趋势。由于抗生素的大量使用，MRSA耐药率逐年增高，耐药程度不断增大，多重耐药现象也日趋严重，MRSA感染的流行和暴发时有发生。MRSA与乙型肝炎、艾滋病共同被列为世界范围内最难解决的三大感染性顽疾^[12]，是临床医学非常关注的严重感染问题。因而加强MRSA的监测、耐药机制研究及分子流行病学研究变得尤为迫切，其结果有助于指导临床制定针对性的预防和控制措施。

MRSA的感染和耐药在人医临床和兽医临床均有报道^[13-14]，然而将人源、动物源与食源性MRSA综合在一起进行分析和研究，国内尚未见报道。本研究分别从安徽省淮北、合肥和马鞍山3个地区采集标本，3个地区分别处于安徽的皖北、皖中及皖南，地理位置覆盖安徽全境，有一定的区域代表性。本研究结果显示：动物性食品如鸡腿，猪肉等MRSA的携带率相对较低(3.1%)，而人医临床(浓汁及伤口分泌物等)和动物标本(猪鼻腔拭子及奶牛场生奶)MRSA携带率较高，分别达到30.0%和25.6%。在我国，医院和社区获得性感染革兰阳性细菌耐药监测研究显示，2001年MRSA的分离率为37.4%^[15-16]，2002-2003年增加到41.0%^[17]。2005年我国5家教学医院革兰阳性球菌耐药监测研究显示，MRSA分离率已达到51.3%，其中上海市的发生率高达78.4%^[18]。本研究中安徽地区的MRSA的分离阳性率略低于全国平均水平。

本试验证明MRSA已经在与人类生活密切相关的动物身上出现。其中在奶牛乳房炎感染中，MRSA菌株的出现呈上升趋势，可能与近年来给动物(尤其是奶牛等经济价值较高的动物)滥用抗生素，导致金黄色葡萄球菌产生耐药相关。本研究发现合肥地区奶牛MASA携带率高达30%。MRSA在奶牛和动物身上的检出对食品卫生安全将是一个非常严峻的考验。

本研究显示，不同来源的MRSA菌株对万古霉素、达福普丁及利奈唑胺100%敏感，结果表明糖肽类抗生素如万古霉素仍可有效治疗MRSA感染；而对包括甲氧西林在内的所有β－内酰胺类抗生素都产生了耐药性，如青霉素和苯唑西林100%耐药；不同来源MRSA对头孢唑啉、红霉素、克林霉素、四环素、庆大霉素、左氧氟沙星、利福平、甲氧嘧啶和氨苄西林有不同程度的耐药，但不同来源MRSA间无差异。

PFGE是目前国内外流行病学研究广泛接受的分型方法之一，与其他方法相比，具有重复性好、分辨率高、分辨力强、结果稳定、易于标准化的优点，能在细菌基因组很庞大的情况下，尽可能反映较多的变异信息，被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”^[19]。PFGE方法主要被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的暴发流行^[20]，还有助于识别散发病例的传染源。最近的研究证实，PFGE与公认的适合于MRSA的MLST结果相比符合率超过95%。PFGE同样能鉴别MRSA的稳定谱系，同样可以用于追踪这些谱系克隆洲际的长时期传播^[21-22]。但是使用PFGE研究金黄色葡萄球菌的长期进化在总体上，特别是MRSA的适用性仍存在争议^[23]。本研究将82株MRSA分为49个PFGE型别，不同来源MRSA的PFGE型别各不相同，同源性较低，显示不同来源MRSA的多克隆性。PFGE是一种较为有效的分型及同源性分析的科学方法，能够从基因水平上阐释菌株之间的同源性关系，将在食源性疾病的防控及食品污染控制等方面有良好的应用前景。

作者贡献:

赵红庆  ORCID：0000-0002-4423-0612

徐萍  ORCID：0000-0002-6788-7289

赵红庆：文章撰写，审阅、定稿

徐萍：数据收集，结果分析

周声安：实验研究

胡守奎：实验设计，文章修改