猪链球菌(Streptococcus suis)是革兰阳性兼性厌氧球菌，属球菌科、链球菌属。根据其荚膜多糖抗原分为35个血清型^[1]，其中2型致病性最强，是人感染猪链球菌病的最主要病原^[2]。患者大多直接与病猪有接触史，人与人之间不传播。人感染猪链球菌病为我国新发传染病，过去猪链球菌被认为很少感染人类，极少发生人间暴发疫情，仅有少量散发病例，但在1998年江苏省发生了人感染猪链球菌病暴发疫情，引起人们对该病危害性的重新认识和重视。2005年，四川省发生人感染猪链球菌血清2型菌株疫情，报道病例215例，死亡39例，疫情波及12个市州^[3]。2005年后，四川省每年均有人感染猪链球菌病散发病例。为了解近10年来该省临床分离的猪链球菌2型菌株特性，笔者对2型菌株进行了多位点序列分型(MLST)分析。

27株菌为2006 -2016年间四川省疾病预防控制中心(CDC)保存的猪链球菌病例分离株。经实验室鉴定为猪链球菌血清2型(猪链球菌分型诊断血清，丹麦Statens Serum Institut公司)，见表 1。

将复苏后的猪链球菌菌株接种于血琼脂平板(郑州安图绿科生物工程有限公司)37 ℃培养过夜，一次性接种环收集适量菌苔，转入200 μl灭菌生理盐水中，制成菌悬液，在沸水浴中煮沸10 min，13 000 r/min 4 min，吸上清液置于-20 ℃备用。

参考King等^[4]推荐的方法，选择猪链球菌基因组上的7个管家基因(aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA)作为目标测序基因，见表 2。聚合酶链反应(PCR)扩增靶基因DNA片段，25 μl PCR反应体系包括12.5 μl GoTaq^® Green Master Mix(Promega公司)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl以及8.5 μl灭菌超纯水，最后加2 μl DNA模板。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，40~55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个温度循环；最后72 ℃延伸10 min。以QIAxcel毛细管电泳仪(QIAGEN公司)及50~800 bp Size Marker(QIAGEN公司)观察PCR扩增结果。PCR扩增产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行DNA双向测序。

双向测序结果经过拼接组装，在GenBank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与已知序列进行比对验证；然后在线递交到猪链球菌MLST分析网络服务器(http://ssuis.mlst.net/)进行分析，用BioNumerics 7.60软件显示MLST分析结果。

27株猪链球菌经7个管家基因片段扩增，均获得了清晰而又单一的目标条带，各个管家基因片段电泳结果见图 1。

图 1 7个管家基因片段PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplification results of the fragments of 7 housekeeping genes 注：A1为50~800 bp Size Marker；A2、A3为aroA；A4、A5为cpn60；A6、A7为dpr；A8、A9为gki；A10、A11为mutS；A12、B1为recA；B2、B3为thrA

图选项

27株猪链球菌血清2型菌株经MLST分型，19株为ST7型，其余为ST1型。其中2007年以前以ST7型(18/19) 为主，2007年之后以ST1型为主(7/8)(表 1)。用BioNumerics 7.60软件显示MLST分析结果，ST1和ST7在聚类分析中被分为2个不同分支，见图 2。

图 2 四川省猪链球菌2型菌株多位点序列分型聚类分析结果 Figure 2 MLST type cluster map of S. suis serotype 2 isolated in Sichuan

图选项

目前关于人染感染猪链球菌病最早的报道为1968年丹麦出现3例人感染猪链球菌导致脑膜炎并发败血症病例^[5]。1975年荷兰也出现散发病例的报道。截至1989年全世界发生人感染猪链球菌引发的脑膜炎病例共108例^[6]。1998年我国江苏省发生了人感染猪链球菌病暴发疫情^[7]，造成25人感染，14人死亡，这是国内首次报道人感染猪链球菌2型。四川省在2005年发生人感染猪链球菌血清2型疫情前，未见关于人感染猪链球菌病的报道。

猪链球菌鉴别诊断主要依靠分型诊断血清，但血清型与致病力之间无必然相关性，猪链球菌相同血清型的不同ST型菌株间存在很大的致病性差异，血清学方法无法准确区分高毒株^[8]。King等^[4]基于猪链球菌基因组上的7个管家基因(aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA)核苷酸序列的不同，建立MLST分型方法用于鉴定猪链球菌。对294株猪链球菌进行MLST分型，共获得92个STs，其中ST1序列群(sequence type complex)是最主要的ST序列群，包括ST1~12，包含了全世界各地的绝大多数高致病性分离株。

MLST分型方法最大的优点是所得序列数据利于各个实验室之间进行交流和比较，易于统一和标准化，也可通过互联网共享，并且用于细菌进化及流行株分布的研究^[9]。Ye等^[10]对2005年引起四川省人感染猪链球菌病的菌株进行深入的分子生物学研究，发现此次疫情主要由ST7型猪链球菌血清2型菌株引起。ST7型猪链球菌对外周血单个核细胞毒性比ST1型更强^[11]；ST7型猪链球菌由ST1型菌株进化而来，与ST1型相比，仅在thrA基因中有一个SNP位点变异。王楷宬等^[12]对22株从猪体内分离到的猪链球菌血清2型菌株进行毒力因子分析及MLST分型研究，发现2005年从四川省以及重庆市分离到的猪链球菌血清2型菌株主要为ST7型，与2005年引起四川省人感染猪链球菌病的菌株属于同一种ST型；2009年从山东省猪体内分离到的5株猪链球菌血清2型菌株全部为ST1型。陈经雕等^[13]对广东省2005 -2008年分离自患者及病猪的22株猪链球菌血清2型菌株进行MLST分析，将其分为ST1、ST7和ST28三个型别，其中ST1、ST7型为患者和病猪菌株共有，ST28为病猪所特有。2010年云南省出现首例人感染猪链球菌病，其血清型为2型，MLST分型为ST1型^[8]。2014年江苏省报道了首例人感染ST1型猪链球菌^[14]。

本研究对四川省2005年之后10年间临床分离到的猪链球菌2型菌株进行MLST分型，2006 -2007年间分离的菌株，95%(18/19) 为毒性更强的ST7型，与2005年引起四川省人感染猪链球菌病疫情暴发的菌株属于同一种ST型。2007年后则以ST1型为主。近10年四川省人感染猪链球病均为散发，未出现暴发疫情，可能与流行菌株的毒力降低相关^[11]。其他省份人感染猪链球菌病的流行菌株是否发生了相同转变，尚需更多流行病学资料证实。

作者贡献:

廖虹瑜  ORCID：0000-0002-4543-4086

廖虹瑜：负责文献收集，实验室检测工作，数据处理及论文撰写

罗隆泽：提供本研究中所用的菌株信息及实验室检测

曾林子、祁腾：实验室检测

杨小蓉：指导实验室检测工作，数据处理，论文修改