手足口病是由人类肠道病毒引起的急性传染性疾病，在世界范围内广泛流行。其临床症状主要为发热以及手、足和口腔等部位的斑丘疹或疱疹，大部分病例症状轻微，但少数重症病例可并发无菌性脑炎、肺炎、急性弛缓性麻痹和心肌炎等，易发生死亡^[1-3]。引起手足口病的主要病原为肠道病毒71型(EV71) 和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)。其他肠道病毒如A组肠道病毒Cox A2、Cox A4、Cox A6、Cox A10和B组肠道病毒埃可病毒(Echo)1~5型等均可引起手足口病^{[2, 4-6]}。

本研究旨在对湖北省部分地区黄石、宜昌、荆门、荆州、恩施、十堰和潜江非EV71和非Cox A16手足口病例病原谱进行分析，对引起手足口病的Cox A6和Cox A10进行分子鉴定，并对其VP1区的基因特征进行分析，初步探讨手足口病Cox A6和Cox A10的分子流行病学特征。

利用湖北省手足口病实验室网络监测系统，采集2016年黄石、宜昌、荆门、荆州、恩施、十堰和潜江地区手足口病监测哨点医院的手足口病患儿咽拭子、肛拭子标本，标本经手足口病网络实验室检测后，随机选取肠道病毒通用核酸检测阳性的非EV71和非Cox A16手足口病阳性标本102份备用。

取200 μl肠道病毒通用核酸检测阳性的非EV71和非Cox A16手足口病咽拭子或肛拭子标本，采用西安天隆公司核酸自动提取试剂，提取出来的总核酸溶于约100 μl的溶解缓冲液中，于-70 ℃保存备用。

测定采用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript one-step RT-PCR Kit，按照试剂盒说明书进行一步法RT-PCR扩增肠道病毒VP1基因区域，参照文献[7]。PCR扩增反应体系为25 μl，扩增条件：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；延伸72 ℃ 7 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析。所得PCR产物直接进行序列测定(由上海生工生物工程有限公司完成)。

A6和Cox A10的VP1基因扩增对1.3步获得的Cox A6和Cox A10进行VP1全基因扩增^[8-9]，采用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript one-step RT-PCR Kit进行一步法RT-PCR反应。扩增条件：反转录50 ℃ 30 min，预变性94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；延伸72 ℃ 7 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析。所得PCR产物直接进行序列测定(由上海生工生物工程有限公司完成)。

将所测得的肠道病毒VP1部分序列拼接后使用Blast进行同源性检索，按照肠道病毒相同基因型核苷酸序列同源性＞75%的原则进行肠道病毒分型鉴定。获得的Cox A6、Cox A10的VP1全基因序列与GenBank中相应的病毒序列进行同源性比较和进化分析。序列分析和进化分析采用DNAStar软件和Mega 5.0软件。

2016年湖北省黄石、宜昌、荆门、荆州、恩施、十堰和潜江地区手足口病网络实验室检测的标本数为3 473份，肠道病毒核酸检测阳性标本2 035份，其中EV71阳性599份(29.4%)，Cox A16阳性522份(25.7%)，其他肠道病毒阳性914份(44.9%)，以其他肠道病毒流行为主。收集102份其他肠道病毒核酸阳性手足口病标本，利用一步法RT-PCR方法扩增部分VP1区域，PCR产物经直接测序后，经Blast与GenBank中相应肠道病毒序列进行同源性比较，确认共检测出肠道病毒阳性83份。Cox A6阳性47例(56.6%)，Cox A10阳性19例(22.9%)，Cox A2阳性2例(2.4%)，Cox A4阳性7例(8.4%)，Cox B4阳性2例(2.4%)，Cox B5阳性2例(2.4%)，Cox B6阳性1例(1.2%)，Echo5阳性1例(1.2%)，Echo9阳性1例(1.2%)，Echo25阳性1例(1.2%)。

A6基因序列特征分析采用一步法RT-PCR方法，扩增Cox A6的VP1基因全序列。Cox A6的VP1基因全长915个核苷酸，共编码305个氨基酸。PCR产物测序获得Cox A6的VP1基因全长序列22份。本研究获得的2016年湖北省Cox A6的VP1全基因序列核苷酸同源性为95.1% ~100.0%，氨基酸同源性为98.4% ~ 100.0%。将湖北省Cox A6与GenBank中收录的我国及其他国家的Cox A6的VP1序列共同进行进化分析比较，发现我国与其他国家Cox A6可分为8个基因谱系(lineage A~H)，见图 1。

图 1 2016年湖北省部分地区Cox A6的VP1基因全长系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of full-length VP1 genes of Cox A6 in some areas of Hubei, 2016

图选项

湖北省Cox A6与A基因谱系毒株的核苷酸同源性最低，为82% ~ 84.3%。与B、C、D、E、F、G和H基因谱系毒株的VP1基因核苷酸同源性递增，分别为88.9%~90.7%、89.2%~90.8%、93.4%~94.8%、92.7%~95.0%、93.8%~95.3%、93.9%~96.3%和96.6%~98.8%。其中与我国H基因谱系Cox A6毒株VP1基因核苷酸同源性最高，进化分析显示与我国H基因谱系的Cox A6毒株具有较近的亲缘关系，与H基因谱系中2012年福建省、2013年江苏省、深圳市、广东省、上海市的Cox A6亲缘关系最近，同源性也较高(97.6%~99.2%)，与A、B和C基因谱系的亲缘关系较远。

采用一步法RT-PCR方法，扩增Cox A10的VP1基因全序列。Cox A10的VP1基因全长894个核苷酸，共编码298个氨基酸。PCR产物测序获得Cox A10的VP1基因全长序列11份。本研究获得的2016年湖北省Cox A10的VP1全基因序列核苷酸同源性为95.2% ~ 100.0%，氨基酸同源性为98.0% ~ 100.0%。湖北省Cox A10与GenBank中收录的我国及其他国家的Cox A10序列进行进化比较，发现我国与其他国家Cox A10可分为7个基因谱系(lineage A~G)，见图 2。湖北省Cox A10与A基因谱系毒株的VP1基因核苷酸序列同源性最低，为76.3%~77.0%。与B基因谱系、C基因谱系Cox A10毒株的VP1基因核苷酸序列同源性均较低，分别为80.1%~82.6%和82.6%~ 83.7%。与D、E和G基因谱系Cox A10毒株的VP1基因的核苷酸同源性较高，分别为94.5%~ 96%、94.1%~ 94.9%和94.9%~98.3%。本研究中湖北省Cox A10与G基因谱系的同源性最高，位于2个不同的进化簇上，其中大部分湖北省Cox A10与G基因谱系的2011年重庆株(KF999732)、2014年云南株(LC013415、LC013463) 的亲缘关系最近。湖北省Cox A10均与A、B基因谱系的Cox A10亲缘关系较远(图 2)。

图 2 2016年湖北省部分地区Cox A10的VP1基因全长系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of full-length VP1 genes of Cox A10 in some areas of Hubei, 2016

图选项

手足口病虽然病情较轻，但部分病例容易引起严重的并发症，病情进展快，病死率高。手足口病病原种类复杂，人群感染某种手足口病相关肠道病毒后，虽然可以获得相应肠道病毒的型特异性免疫，但对其他型别的肠道病毒感染缺乏交叉保护^[10]。虽然EV71和Cox A16是引起我国手足口病暴发和流行的主要病原体，但近年Cox A6和Cox A10逐渐成为主要病原体，福建、北京、浙江、山东、河南、重庆和深圳等省(直辖市)也有相关报道^{[6, 9, 11-14]}。同时还发现少量Cox A2、Cox A4、Cox B4、Cox B5、Cox B6、Echo5、Echo9和Echo25其他型别的肠道病毒。

肠道病毒VP1基因是肠道病毒基因分型和遗传进化分析的重要基因，并可作为肠道病毒进化分析的标准^[15]。我国与其他国家Cox A6和Cox A10分别划分为8个(lineage A~H)和7个(lineage A~G)基因谱系。湖北省Cox A6与我国H基因谱系的同源性最高，为96.6%~98.8%，与我国其他地区H基因谱系的Cox A6毒株具有较近的亲缘关系。湖北省Cox A6在进化关系上分别位于3个不同的进化簇，说明不同进化簇的Cox A6与地域起源有关，具有明显的地域分布特征。2016年湖北省部分地区Cox A10的VP1基因序列与G基因谱系的同源性最高，为94.9% ~ 98.3%，与我国G基因谱系的Cox A10毒株具有较近的亲缘关系，与A、B基因谱系亲缘关系较远。湖北省Cox A10进化具有不同的进化起源。

本研究通过对2016年湖北省其他肠道病毒的病原构成分析和Cox A6、Cox A10的基因进化分析，了解该省手足口病主要病原体流行特征，为当地手足口病防治提供参考依据。

作者贡献:

ORCID：0000-0001-8649-300X

李静：完成肠道病毒鉴定、基因测序、序列分析，并起草完成文章撰写

邹文菁、张婷、占建波：主要完成肠道病毒检测、基因分型鉴定PCR

杨朝晖：样本的收集与资料整理