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文章信息
- 孟凡亮, 陶晓霞, 宋衍燕, 张建中, 闫笑梅
- MENG Fan-liang, TAO Xiao-xia, SONG Yan-yan, ZHANG Jian-zhong, YAN Xiao-mei
- 北京市健康从业人员携带金黄色葡萄球菌肠毒素特征分析
- Distribution of 20 enterotoxin and enterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus strains isolated from healthy carriers in Beijing
- 疾病监测, 2017, 32(4): 337-341
- Disease Surveillance, 2017, 32(4): 337-341
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.04.019
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文章历史
- 收稿日期:2016-12-23
2. 北京市朝阳区疾病预防控制中心, 北京 100021
2. Chaoyang District Center for Disease Control and Prevention, Beijing, Beijing 100021, China
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus, SA) 是一种条件致病菌,可以在动物及人类广泛定植, 能够引起感染,从较轻的皮肤软组织感染到侵袭性心内膜炎、毒素休克综合征、烫伤样皮肤综合征、骨髓炎、坏死性肺炎和脓毒血症等。同时金黄色葡萄球菌也是一种重要的食源性致病菌,通过分泌肠毒素 (Staphylococcal enterotoxins, SEs) 可以引起食物中毒[1]。肠毒素的命名主要依据其催吐活性,能引起哺乳动物呕吐的肠毒素被命名为肠毒素,而不能引起呕吐或未测定的则命名为类肠毒素。目前已经报道超过20种SEs和类肠毒素 (SE-like toxins, SEls)[2]。肠毒素主要包括SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SER、SES和SET。灵长类动物 (猴子) 实验表明,经典肠毒素 (SEA、SEB、SEC、SED和SEE) 每只动物只需要5~100 μg,即可导致呕吐反应,均具有较强的食物中毒毒力[2]。类肠毒素包括SElJ、SElK、SElL、SElM、SElN、SElO、SElP、SElQ、SElU、SElV、SElX和SElY。肠毒素及类肠毒素均具有超抗原活性,可以选择性地激活大量T细胞,刺激大量炎性因子释放,进而引起发热、低血压,甚至可能导致致死性休克[3]。食品被操作者携带的金黄色葡萄球菌污染,是导致食物中毒非常重要的原因[4]。目前国内对于健康从业人员的金黄色葡萄球菌携带及其肠毒素携带情况数据匮乏。2009-2011年中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室金黄色葡萄球菌疾控组对北京地区1 530名健康从业人员进行调查,发现金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA) 的人群携带率分别为13.46%和0.06%[5]。本研究的目的旨在进一步分析这些菌株的肠毒素分布情况。
1 材料与方法 1.1 研究对象肠毒素分析选取2009-2011年收集的北京市朝阳区健康从业人员鼻部携带金黄色葡萄球菌共100株,全部为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA)。职业包括家政人员 (62人)、超市销售人员 (21人)、厨师 (13人)、餐厅服务员 (3人)、幼儿园老师 (1人)。
1.2 实验菌株金黄色葡萄球菌用5%羊血的哥伦比亚培养基,37 ℃培养18 h。菌株鉴定包括乳胶凝集实验和nuc基因检测[6]。
1.3 试剂与仪器乳胶凝集实验用英国OXOID公司试剂盒 (DR0100M),金黄色葡萄球菌染色体提取试剂盒 (DNeasy blood and tissue kit) 为QIAGEN公司产品;溶葡萄球菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR仪 (MycyclerTM thermal cycler) 和凝胶成像系统 (CHEF DR Ⅲ System) 为美国伯乐公司产品。PCR引物合成由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成,测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。
1.4 肠毒素检测肠毒素检测基因和检测引物见表 1。
基因 | 引物 | 序列 (5′~3′) | 产物长度 (bp) | 参考文献 |
sea | GSEAR-1 | GGT TAT CAA TGT GCG GGT GG | 102 | [7] |
GSEAR-2 | CGG CAC TTT TTT CTC TTC GG | |||
seb | GSEBR-1 | GTA TGG TGG TGT AAC TGA GC | 164 | [7] |
GSEBR-2 | CCA AAT AGT GAC GAG TTA GG | |||
sec | GSECR-1 | AGA TGA AGT AGT TGA TGT GTA TGG | 451 | [7] |
GSECR-2 | CAC ACT TTT AGA ATC AAC CG | |||
sed | GSEDR-1 | CCA ATA ATA GGA GAA AAT AAA AG | 278 | [7] |
GSEDR-2 | ATT GGT ATT TTT TTT CGT TC | |||
see | GSEER-1 | AGG TTT TTT CAC AGG TCA TCC | 209 | [7] |
GSEER-2 | CTT TTT TTT CTT CGG TCA ATC | |||
seg | seg-f | CGT CTC CAC CTG TTG AAG G | 327 | [8] |
seg-r | CCA AGT GAT TGT CTA TTG TCG | |||
seh | seh-f | CAA CTG CTG ATT TAG CTC AG | 360 | [8] |
seh-r | GTC GAA TGA GTA ATC TCT AGG | |||
sei | sei-f | CAA CTC GAA TTT TCA ACA GGT AC | 465 | [8] |
sei-r | CAG GCA GTC CAT CTC CTG | |||
selj | sej-1 | CAT CAG AAC TGT TGT TCC GCT AG | 142 | [8] |
sej-2 | CTG AAT TTT ACC ATC AAA GGT AC | |||
selk | SEK-1 | CGC TCA AGG CGA TAT AGG AA | 570 | [9] |
SEK-2 | GGT AAC CCA TCA TCT CCT GTG T | |||
sell | SEL-1 | CAC CAG AAT CAC ACC GCT TA | 240 | [10] |
SEL-2 | CTG TTT GAT GCT TGC CAT TG | |||
selm | SEM-1 | GGA TAA TTC GAC AGT AAC AG | 379 | [11] |
SEM-2 | TCC TGC ATT AAA TCC AGA AC | |||
seln | SEN-1 | TAT GTT AAT GCT GAA GTA GAC | 282 | [7] |
SEN-2 | ATT TCC AAA ATA CAG TCC ATA | |||
selo | SEO-1 | TGT GTA AGA AGT CAA GTG TAG | 214 | [11] |
SEO-2 | TCT TTA GAA ATC GCT GAT GA | |||
selp | SEP-1 | GAA TTG CAG GGA ACT GCT TT | 537 | [9] |
SEP-2 | ACC AAC CGA ATC ACC AGA AG | |||
selq | SEQ-1 | GAA CCT GAA AAG CTT CAA GGA | 509 | [9] |
SEQ-2 | CCA GTT CCG GTG TAA AAC AAA | |||
ser | SER-1 | TTC AGT AAG TGC TAA ACC AGA TCC | 367 | [12] |
SER-2 | CTG TGG AGT GCA TTG TAA CGC C | |||
ses | SES-1 | AAT GCA ATT TGC CCC ATA GT | 305 | 本研究 |
SES-2 | ACC GCT TTG TTC AAG CAG AT | |||
set | SET-1 | TCG GGT GTT ACT TCT GTT TGC | 165 | 本研究 |
SET-2 | TTA TGT AGA TGC TTG GGG ACA | |||
selu | SEU-1 | ATG GCT CTA AAA TTG ATG GTT CTA | 409 | [12] |
SEU-2 | GCC AGA CTC ATA AGG CGA ACT A |
SEA-E和SEG-J用多重PCR检测。多重PCR采用50 μl体系,dNTP mix 4 μl, 10×buffer 5 μl, MgCl2 4 μl, DNA聚合酶2 μl,每个引物2 μl,DNA模板2 μl。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 1 min,68 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,15个循环;95 ℃ 1min,64 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,16个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃冷却结束。
其他肠毒素及类肠毒素的基因采用单重PCR检测,单重PCR采用20 μl体系:2×Easy Taq Super Mix 10 μl,上下游引物各1 μl,DNA 1 μl,水7 μl。反应条件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,30个循环;72 ℃ 7 min,4 ℃冷却结束。
PCR所选阳性对照,为实验室已经测序的阳性菌株。阳性对照菌株分别为SEA (A139)、SEB (A08024)、SEC (A183)、SEG (A07009)、SEH (ATCC 51811/A183)、SEI (ATCC29213/A07009)、SElJ (BJ0085)、SElK (BJ0506)、SElL (BJ0085)、SElM (N315)、SElN (N315)、SElO (N315)、SElP (BJ0328)、SElQ (BJ0660)、SER (BJ0085) 和SElU (BJ0437)。
1.5 spa分型和多位点序列分型 (MLST) 分析所有菌株进行spa分型,依据网站 (http://www.seqnet.org/),引物序列分别为spa F:5′-ACG ATC CTT CGG TGA GC-3′和spa R:5′-CAG CAG TAG TGC CGT TTG-3′,分析软件为Ridom Staph Type 1.5.12。MLST分型依据网站www.mlst.net公布的扩增基因引物名称、引物序列、PCR反应条件进行扩增。扩增产物直接送公司进行纯化和测序,测序采用双相测通方法。本次研究所用部分菌株的spa和MLST分型结果已经发表[13-14]。
2 结果 2.1 肠毒素检测结果本次实验检测的100株健康人携带菌株,64株菌 (64%) 携带1种或多种肠毒素基因。肠毒素基因sea、seb、sec、seg、seh、sei、selj、selk、sell、selm、seln、selo、selp、selq、ser和selu的检出率分别为17%、14%、12%、15%、3%、4%、13%、4%、14%、14%、1%、11%、10%、10%、13%和6%。肠毒素基因sed、see、ses和set 未检出。经典肠毒素 (sea-see) 的携带率为41%。最常见的肠毒素谱为sea、selp、seb和sec-seg-selm-selo-selj-sell-ser, 检出率分别为10%、10%、6%和4%, 见表 2。有7株菌携带部分egc基因簇,有1株菌携带完整的egc基因簇 (seg-sei-selm-seln-selo-selu)。
基因型别 | 数量 | spa型别 (数量) | MLST型别 (数量) |
sea | 10 | t1107(1) t701(5) t304(1) t127(1) t286(1) t034(1) | ST211S ST6(4) ST401(2) ST2115(1) ST2114(1) ST2814(1) ST398(1) |
selp | 10 | t091(3) t796(5) t2592(2) | ST7(3) ST2141(2) nt (5) |
seb | 6 | t189(3) t437(1) t163(2) | ST2139(3) ST2138(2) ST2751(1) |
sec-seg-selm-selo-selj-sell-ser | 4 | t002(2) t105(1) t4867(1) | ST25(2) ST5(1) ST2394(1) |
seb-selq | 3 | t163(2) t437(1) | ST2138(1)2800(1) ST2147(1) |
sec-sell | 3 | t8099(2) t5502(1) | ST398(1) ST2140(1) ST2146(1) |
seg-selm-selo | 3 | t078(1) t164(2) | ST2142(2) ST25(1) |
sea-selq | 2 | t768(1) t127(1) | ST1(1) ST401(1) |
sea-seb | 2 | t701(1) t3471(1) | ST6(1) ST2143(1) |
seb-selk-selq | 2 | t437(1) t1151(1) | ST2147(1) ST59(1) |
selj-ser | 2 | t1265(1) t9101(1) | ST1490(1) nt (1) |
sell | 1 | t091(1) | ST7(1) |
selu | 1 | t1425(1) | ST121(1) |
sea-seh-selq | 1 | t127(1) | ST401(1) |
sea-selu | 1 | t338(1) | ST378(1) |
sea-sei-selk-selq | 1 | t127(1) | ST401(1) |
seb-sell | 1 | t002(1) | ST25(1) |
sec-seg-sei-selj-sell-selm-selo-ser-selu | 1 | t002(1) | ST25(1) |
sec-seg-sei-selm-selo-selj-sell-ser | 1 | t002(1) | ST25(1) |
sec-selj-sell-ser | 1 | t002(1) | ST25(1) |
sec-seg-selm-selj-sell-ser | 1 | t002(1) | ST25(1) |
sec-seh-sell | 1 | t127(1) | ST401(1) |
seg-selj-ser | 1 | t548(1) | ST2144(1) |
seg-selm-selo-selj-ser | 1 | t548(1) | ST2144(1) |
seg-sei-selm-seln-selo-selj-ser-selu | 1 | t548(1) | ST2144(1) |
seg-selm-selu | 1 | t9103(1) | ST121(1) |
seg-seh-selm-selu | 1 | t616(1) | ST944(1) |
selk-selq | 1 | t9104(1) | ST630(1) |
注:nt未分型。 |
肠毒素与spa及MLST型别的关系见表 2。14株ST398菌株,肠毒素携带率低,只有2株菌 (14.3%,2/14) 分别携带sea和sec-sell。9株ST25型菌株,8株携带1种以上肠毒素,全部为spa t002型,其中7株菌携带经典的肠毒素基因,6株菌携带不完整的egc基因簇,6株菌携带selj-ser和sec-sell基因簇。9株ST2139型菌株,只有3株携带单一seb肠毒素基因。6株spa t796型 (MLST未分型) 菌株中有5株携带单一selp肠毒素基因。肠毒素sea主要分布在ST6(29.4%,5/17) 和ST401(29.4%,5/17) 型菌株。肠毒素seb主要分布在ST2138(21.4%,3/14) 和ST2139(21.4%,3/14) 型菌株。
3 讨论本研究发现北京地区健康从业人员携带1种或多种金黄色葡萄球菌肠毒素检出率为64%。目前尚未检索到国内关于成年健康人携带金黄色葡萄球菌肠毒素的报道,北京市东城区哨点医院儿童金黄色葡萄球菌携带者的肠毒素检测率为56%[15],略低于本次研究结果。国内患者分离菌株肠毒素携带率较高,大部分报道超过50%[16]。本研究目标人群肠毒素的检出率高于文献报道的韩国社区健康人群的携带率 (36%)[17]。
本研究发现健康从业人员最常见的肠毒素谱为sea。SEA是国际上以及我国导致食物中毒菌株最常见的肠毒素型别[18-20]。SEA肠毒素通常由噬菌体携带,目前已经发现的携带肠毒素A的前噬菌体包括ΦSa3ms、ΦSa3mw、Φ252B、ΦMu3A、ΦNM3、ΦSaTW20和ΦMu50a,均属于Siphoviridae家族的噬菌体成员[21]。单独的sea基因主要由前噬菌体Φ252B、ΦMu3A、ΦMu50a、ΦNM3和ΦSaTW20携带。本研究发现肠毒素sea主要分布在ST6(29.4%,5/17) 和ST401(29.4%,5/17) 型菌株。ST6型菌株是我国金黄色葡萄球菌食物中毒的一个重要型别[20, 22]。噬菌体可以通过水平转移在菌株间播散,尤其是同一克隆系的菌株。本研究发现的ST6型菌株携带经典肠毒素SEA, 可能通过菌株间噬菌体的水平转移在健康从业者之间播散,进而增加食物中毒发生的概率。
类毒素与食物中毒的关系一直不是十分明确。最近有研究者对7种类毒素 (SElK、SElL、SElM、SElN、SElO、SElP和SElQ) 的催吐活性进行评价,发现它们均可以引起猴子的呕吐反应,此结果表明这些类毒素可能与葡萄球菌食物中毒密切相关[23]。类毒素selp也是本次研究的一个常见毒素类型。单独的selp基因主要由前噬菌体ΦSa3n和Φ04-02981携带。携带单一selp肠毒素基因的菌株50%属于spa t796型 (MLST未分型),说明此型类肠毒素也存在同一克隆系水平传播的现象。健康从业人员selp类肠毒素基因的高携带率可能成为食物中毒不可忽视的危险因素。
ST398型金黄色葡萄球菌作为我国北方动物和健康人携带常见的流行型别,一直引起关注[5, 24]。本研究发现,14株ST398菌株,只有2株携带肠毒素。肠毒素及类毒素通常位于移动原件上,可能这些菌株缺失携带肠毒素相应的移动原件。这些菌株其他毒素的携带情况及基因组的整体特征值得进一步分析。
综上所述,本研究发现健康从业人员金黄色葡萄球菌肠毒素基因的高携带率可能成为食物中毒不可忽视的危险因素。为了有效预防食物中毒事件的发生,需要对从业人员进行严格的岗前培训,手部卫生管理,同时注意食物操作间的整体卫生状况。对于手部有皮肤软组织感染的从业人员应禁止其在感染期间从事食品加工工作。
作者贡献:
孟凡亮 ORCID:0000-0003-0518-8893
孟凡亮:负责实验的全过程,论文书写
陶晓霞:配合整个实验过程
宋衍燕:负责样品收集工作
张建中、闫笑梅:负责技术监督和理论指导
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