疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (4): 323-327

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管晓庆, 廖勇, 李建华, 王文, 陈志海
GUAN Xiao-qing, LIAO Yong, LI Jian-hua, WANG Wen, CHEN Zhi-hai
江西省赣州市两株冠状病毒的全基因组遗传特征分析
Genetic analysis of complete genome of two coronaviruses strains isolated in Ganzhou, Jiangxi
疾病监测, 2017, 32(4): 323-327
Disease Surveillance, 2017, 32(4): 323-327
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.04.016

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收稿日期:2017-02-27
江西省赣州市两株冠状病毒的全基因组遗传特征分析
管晓庆1, 廖勇2, 李建华2, 王文3, 陈志海1     
1. 北京大学地坛医院教学医院, 北京 100015;
2. 赣州市疾病预防控制中心, 江西 赣州 341000;
3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所人兽共患病室, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
摘要目的 分析江西省赣州市2株亚洲鼩鼱携带冠状病毒的全基因组遗传特征。方法 用反转录-聚合酶链式反应及RACE方法从亚洲鼩鼱粪便中扩增其全基因组;利用MegAlign软件进行序列同源性分析;利用phyML软件构建系统发育树。结果 全基因组的同源性分析表明毒株GZ01、GZ02与已知的亚洲鼩鼱携带冠状病毒的序列具有很高的同源性(88.6%~92.1%)。系统发育分析表明毒株GZ01、GZ02与上述序列有最近的亲缘关系。结论 赣州市亚洲鼩鼱携带α属冠状病毒,与已知的毒株为同一种冠状病毒,系统发育分析发现亚洲鼩鼱在冠状病毒的起源与进化过程中起着重要作用。
关键词冠状病毒    同源性分析    进化分析    
Genetic analysis of complete genome of two coronaviruses strains isolated in Ganzhou, Jiangxi
GUAN Xiao-qing1, LIAO Yong2, LI Jian-hua2, WANG Wen3, CHEN Zhi-hai1     
1. Beijing Ditan Hospital, Peking University Teaching Hospital, Beijing 100015, China;
2. Ganzhou Center for Disease Control and Prevention, Ganzhou 341000, Jiangxi, China;
3. State Key Laboratory for Communicable Disease Control and Prevention, Department of Zoonosis Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: WANG Wen, Email:wangwen@icdc.cn; CHEN Zhi-hai, Email:13501340403@126.com.
Abstract: Objective To investigate the genetic characteristics of two strains of coronaviruses carried by Asian house shrew in Ganzhou. Methods The complete genome sequences of 2 coronavirus strains isolated from stool samples of Asian house shrew were amplified by using RT-PCR and RACE. The nucleotide sequences similarity was calculated with software MegAlign. Phylogenetic analysis was performed by using software phyML. Results The nucleotide sequences of whole genome of GZ01 strain and GZ02 strain shared the high homology (88.6%-92.1%) with other strains of coronaviruses previously detected in Asian house shrew. Phylogenetic analysis confirmed that GZ01 and GZ02 strains had the closest relationship with these strains. Conclusion Coronavirus carried by Asian house shrew from Ganzhou belonged to alphacoronaviruses.
Key words: Coronavirus     Homology analysis     Phylogenetic analysis    

冠状病毒 (CoVs) 能够引起人类与动物的呼吸道、肠道、肝脏、神经系统疾病等。冠状病毒最早于1937年从鸡的感染组织中被发现。2002-2003年期间,我国暴发的非典型肺炎 (非典) 疫情即由SARS-CoV引起[1-2],随后迅速蔓延至全世界,死亡率达10%[3]。2012年9月,沙特阿拉伯王国 (沙特) 首先出现由MERS-CoV引起的中东呼吸综合征 (MERS) 病例[4],继而在中东其他国家及欧洲蔓延[5],死亡率达38%[6]。2015年5月29日,我国出现首例输入性MERS确诊病例[7]。这2种高死亡率的新发传染病的出现,引起了人们对冠状病毒的高度重视[8]

冠状病毒亚科冠状病毒属,是单股正链RNA病毒,大小为27~32 kb,是目前已知RNA病毒中最长的。基因组包含6~12个开放阅读框 (ORF),5′末端有帽结构,3′末端有poly A尾。在所有冠状病毒的全基因组中,编码复制酶多聚蛋白以及4种结构蛋白的基因排列次序均相同,即5′-ORF1ab-S-E-M-N-3′,编码辅助蛋白的基因散布在结构蛋白基因之间。编码辅助蛋白的基因在基因数目、核苷酸序列以及次序上往往依不同的冠状病毒而有较大差异[9]。根据国际病毒分类委员会第九次报告的定义[10],冠状病毒分为α、β、γ与δ 4个属。其中β属冠状病毒又可以进一步分为A、B、C、D 4个系。SARS-CoV与MERS-CoV分别属于β属冠状病毒的B系与C系。α与β属冠状病毒主要感染哺乳动物,γ与δ冠状病毒主要感染禽类。α属冠状病毒主要包括人冠状病毒229E与NL63、猪传染性胃肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻冠状病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒等;β属冠状病毒主要有SARS-CoV、MERS-CoV、人冠状病毒HKU1与OC43、小鼠肝炎病毒 (Murine hepatitis virus,MHV) 等;禽冠状病毒主要包括鸡传染性支气管炎病毒与火鸡冠状病毒。有多项研究表明,蝙蝠是SARS-CoV与MERS-CoV的起源[11],而果子狸与单峰骆驼分别作为二者的中间宿主[12-14]。我国目前对亚洲鼩鼱携带冠状病毒的情况尚无系统研究。本研究通过对江西省赣州市的2株亚洲鼩鼱携带的冠状病毒进行全基因组序列测定,经同源性和系统进化树分析发现,与已知的亚洲鼩鼱毒株有最高的同源性与最近的亲缘关系。

1 材料与方法 1.1 标本来源及采集

2014年在赣州市的居民区以及野外采集亚洲鼩鼱。以油条为诱饵用鼠笼捕捉,经形态学鉴定后,无菌条件下解剖取其直肠,-80 ℃冰箱中保存。

1.2 试剂来源

粪便总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司;One Step PrimeScript RT-PCR试剂盒、DNA Marker、胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、pMD 19-T载体、DH5α感受态细胞均购自TaKaRa公司。

1.3 RNA提取、病毒核酸检测及全基因组扩增

取50 mg粪便标本置于2 ml无RNase的离心管中,参照百泰克生物技术有限公司的RNA提取试剂使用说明书提取粪便RNA。使用引物经半巢式RT-PCR方法扩增冠状病毒基因组RdRp的部分区域检测病毒核酸。综合分析美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 提交的冠状病毒的核苷酸序列,自行设计了扩增病毒全基因组的引物。5′与3′端用TaKaRa公司的RACE试剂盒扩增。

1.4 PCR产物的克隆、筛选与测序

用TaKaRa公司的试剂盒回收预期目的大小的PCR扩增产物,与T载体连接,转化大肠埃希菌感受态细胞,将大肠埃希菌涂在含有氨苄西林的LB固体培养基上进行培养。挑选白色菌落,接种在LB液体培养基中,以菌液为模板进行PCR鉴定。阳性克隆送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序,每个PCR扩增产物至少送3个阳性克隆。

1.5 序列分析

用Lasergene 7.1软件中的SeqMan程序拼接测序结果,用MegAlign程序进行核苷酸同源性分析。使用Mega 6.06软件进行序列比对,然后用phyML 3.1软件中的最大似然法 (Maximum Likelihood,ML) 构建系统发育树。构建RdRp、S、N进化树用的核苷酸序列长度分别为2 778 bp、3 735 bp、1 227 bp。

2 结果 2.1 冠状病毒的检测

本次调查共捕获亚洲鼩鼱40只。形态学鉴定后,从粪便标本中提取总RNA,经半巢式RT-PCR扩增基因组RdRp的部分区域检测病毒核酸,在2份样本中获得了与预期大小相符合的目的片段,长度约为450 bp。目的片段经克隆后进行测序。将测序结果进行Blastn比对,发现2条序列均属于α属冠状病毒,分别命名为GZ01、GZ02。冠状病毒在亚洲鼩鼱中的阳性率为5%。

2.2 全基因组特征

以RT-PCR结合RACE的方法扩增病毒的全基因组。毒株GZ01与GZ02的全长分别为26 010 bp、26 039 bp,G+C的含量分别为31.95%和31.86%。这2株病毒的基因组结构为5′NCR-ORF1ab-S-NS3-E-M-N-NS7-3′NCR,见图 1。其中ORF1ab为多聚酶基因,S、E、M、N为结构蛋白基因,NS3与NS7为辅助蛋白基因。7个开放阅读框的起始与终止位点、核苷酸数、氨基酸数见表 1。这2株病毒的转录调控序列的核心序列是5′-CUAAAC-3′或5′-AACUAA-3′,与大多数α冠状病毒相同[15-17],但是NS3与NS7上游未找到转录调控序列。

图 1 毒株GZ01与GZ02的基因组结构 Figure 1 Structure of genome of strains GZ01 and GZ02
表 1 毒株GZ01与GZ02的编码区及转录调控序列 Table 1 Coding potential and putative transcription regulatory sequences of GZ01 and GZ02
毒株开放阅读框核苷酸位点 (起始~终止)核苷酸数氨基酸数转录调控序列 (5′~3′)
GZ011ab274~19 20818 9366 312CUAAAC
S19 215~22 6223 4081 136AACUAA
NS322 622~23 335714238-
E23 316~23 54322876CUAAAC
M23 556~24 245690230CUAAAC
N24 249~25 3491 101367CUAAAC
NS725 336~25 743408136-
GZ021ab275~19 23618 9636 321CUAAAC
S19 243~22 6503 4081 136AACUAA
NS322 650~23 363714238-
E23 344~23 57122876CUAAAC
M23 584~24 273690230CUAAAC
N24 277~25 3771 101367CUAAAC
NS725 364~25 771408136-

毒株GZ01、GZ02与已知的亚洲鼩鼱中检测到的α属冠状病毒Ruian-133与Wencheng-554有最高的同源性。与上述2个参考毒株相比,GZ01的全基因组序列同源性在88.6%~92.1%之间,GZ02的全基因组序列同源性在88.6%~92.0%之间;GZ01RdRp的核苷酸同源性分别在91.8%~93.8%之间,GZ02RdRp的核苷酸同源性在91.8%~93.5%之间;GZ01 S的核苷酸同源性分别在95.7%~96.6%之间,GZ02 S的核苷酸同源性在96.2%~96.8%之间;GZ01 N的核苷酸同源性分别在89.7%~93.7%之间,GZ02 N的核苷酸同源性在90.2%~93.2%之间。国际病毒分类委员会对冠状病毒新种的定义为ADRP、3CLpro、RdRp、Hel、ExoN、NendoU、O-MT蛋白的氨基酸同源性均<90%。本研究发现的毒株GZ01与GZ02的ADRP、3CLpro、RdRp、Hel、ExoN、NendoU、O-MT蛋白与Ruian-133、Wencheng-554的氨基酸同源性均>90%,因此毒株GZ01、GZ02与已知的毒株Ruian-133、Wencheng-554属于同种冠状病毒。

2.3 系统发育树

RdRp、S、N构建的系统发育树见图 2。在RdRp构建的系统发育树中,α属冠状病毒分为2个大的分支。毒株GZ01、GZ02与Ruian-133、Wencheng-554聚在一起,形成一个独立的分支,位于进化树根部的位置;α属冠状病毒中其他毒株亲缘关系均较近,宿主包括啮齿动物、蝙蝠、猪以及人等,构成另一大分支。在S构建的系统发育树上,α属冠状病毒也分为2个大的分支。与RdRp构建的系统发育树不同的是,毒株GZ01、GZ02与Ruian-133、Wencheng-554聚在一起,形成一个独立的小分支,然后与啮齿动物中发现的冠状病毒Lucheng Rn rat coronavirus (LRNV) Lucheng-19聚在一起,再与蝙蝠中发现的冠状病毒BtRf-AlphaCoV/YN2012、Rhinolophus bat coronavirus HKU2聚在一起,所有这些毒株构成一个大的分支,位于α属冠状病毒较原始的位置。毒株LRNV Lucheng-19由Wang等[18]在我国浙江省的褐家鼠中检测到。在N构建的系统发育树上,毒株GZ01、GZ02与Ruian-133、Wencheng-554聚在一起,单独形成一支。

图 2 基于RdRp、S、N基因用最大似然法构建的进化树 Figure 2 Phylogenetic trees based on RdRp, S, N nucleotide sequences by ML methods
3 讨论

亚洲鼩鼱适应力极强,遍布世界的每个角落 (南美种类较少),成为哺乳动物除啮齿目、翼手目外的第三大目,世界约有200多种,我国约有30多种[19]。亚洲鼩鼱分布于我国甘肃、浙江、江西、湖南、贵州、四川、云南、台湾、福建、广东、广西、海南等地。亚洲鼩鼱是鼠疫、钩端螺旋体病、恙虫病和肾综合征出血热病毒等病原体的贮存宿主。本研究中亚洲鼩鼱携带冠状病毒的阳性率为5%。通过初期的病毒检测和全基因组序列的测定,获得2株冠状病毒的序列。同源性分析表明,毒株GZ01、GZ02与已知的毒株Ruian-133、Wencheng-554属于同种冠状病毒。系统进化分析表明,毒株GZ01与GZ02与已知的毒株Ruian-133、Wencheng-554有最近的亲缘关系,除此之外,与啮齿动物、蝙蝠携带的冠状病毒有较近的亲缘关系。

本研究在亚洲鼩鼱中仅检测到1种冠状病毒,且2毒株之间以及与已知的毒株之间都具有很高的同源性。同样作为小型哺乳动物的啮齿动物与蝙蝠,二者携带的冠状病毒有着更丰富的遗传多样性。啮齿动物可以携带多种冠状病毒,如LRNV、MHV等。LRNV为α属冠状病毒,代表毒株为LRNV Lucheng-19,除此之外,2016年Tsoleridis等[20]在英国、波兰等地的褐家鼠、平原田鼠 (Microtus agrestis)、银行田鼠 (Myodesglareolus) 中也检测该种冠状病毒;MHV为β属冠状病毒,代表毒株为Murine hepatitis virus JHM,还存在HKU24、LRLV (LongquanRl rat coronavirus)、LAMV (LongquanAa mouse coronavirus) 等亚型。广东省在褐家鼠中检测到HKU24[21]。蝙蝠所携带的冠状病毒基因多样性极其丰富,已经从蝙蝠中发现了多种冠状病毒,从α属冠状病毒Rhinolophus bat coronavirus HKU2、Miniopterus bat coronavirusHKU8、Scotophilus bat coronavirus 512、Rousettus bat coronavirus HKU10到β属冠状病毒Rhinolophussinicus BtCoV/Rs3367、Rhinolophussinicus Yunnan 2013、Tylonycteris Rhinolophus bat coronavirus HKU4、Pipistrellus bat coronavirus HKU5、Neoromicacapensis BtCoV/NeoCoV等。其中,Rhinolophussinicus BtCoV/Rs3367除ORF8基因外,与SARS-CoV有最高的同源性,而Rhinolophussinicus Yunnan2013的ORF8基因与SARS-CoV有最高的同源性 (98%);Rhinolophus bat coronavirus HKU4、Pipistrellus bat coronavirus HKU5、Neoromicacapensis BtCoV/NeoCoV与MERS-CoV的核苷酸同源性分别为69.8%、70%和85.6%[11]

综上所述,赣州市亚洲鼩鼱携带的冠状病毒与已知的毒株为同一种冠状病毒,系统发育分析发现亚洲鼩鼱在冠状病毒的起源与进化过程中起着重要作用。因此,系统地开展冠状病毒的分子流行病学研究、对发现是否还存在新型冠状病毒及其致病性、冠状病毒的变化规律及其进化关系具有重要的指导意义,而且有助于阐明冠状病毒的生物学特性。

作者贡献:

管晓庆  ORCID:0000-0001-8010-5715

管晓庆:实验室工作、数据分析、论文撰写

廖勇:标本采集

李建华:标本采集

王文:实验室工作

陈志海:实验设计与指导

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