基于微生物诱导碳酸钙沉积(microbial-induced calcitum precipitation，MICP)的生物水泥技术是利用微生物自身新陈代谢活动产物，处理软弱土体以改善其物理力学特性的一项技术^[1-3]。该处理过程大多是基于机制简单的尿素水解过程，由微生物分泌的脲酶水解尿素产生碳酸根离子，与细菌细胞周围环境中游离的钙离子结合析出具有胶结作用的碳酸钙晶体固化软弱土体^[4-6]。

MICP本质上是化学反应，因此反应速率是一个重要的参数，将会影响试验中处理液(一般指氯化钙和尿素混合溶液)对试样的处理时间以及更换频率，影响整个试验进程。对于MICP胶结过程的反应时间目前并没有一个明确的结论，相关学者开展试验所采用的反应时间从几小时到若干天不等，差异显著^{[4, 7-10]}。此外，已开展的MICP研究多关注与胶结后土体的强度、渗透性等方面的变化^{[4-5, 8, 11-12]}，而关于胶结过程中的反应速率问题，还鲜有研究成果发表。Whiffin^[6]在尿素溶液中加入细菌溶液后测量电导率变化率，并同时测量完全水解的尿素的量，得到了电导率变化率和脲酶活性的经验关系。由于脲酶活性在一段时间内是稳定的^[10]，因此可以用脲酶活性来表征经验反应速率。但该脲酶活性的测定是在纯尿素溶液中进行的，而在实际胶结过程中，混合液中的钙离子会对脲酶活性产生抑制作用^{[10, 13]}，反应过程中生成的碳酸钙沉淀也可能会对尿素进入细胞以及碳酸根离子的排出细胞产生影响^{[3, 14]}。此外，Zhou等^[15]和李洋洋等^[16]发现颗粒面积与微生物活性以及胶结后土体的无侧限抗压强度有一定的关系，说明颗粒面积是MICP胶结过程中的一个重要参数。

本文通过试验探究MICP过程在颗粒存在情况下的反应速率。通过滴定钙离子浓度测定MICP反应过程中试样中的钙离子浓度变化，研究土颗粒存在对MICP反应过程中反应速率的影响，并与经验计算结果进行对比分析，为MICP室内试验以及工程实践提供一定参考。

1 材料与方法 1.1 主要材料

1) 粗粒土。

粒径范围为0.5~40 mm的粗粒土，干密度为2.58~2.62 g/cm³左右。试验前冲洗并晾干。

2) 模具。

内径5.1 cm，高15 cm塑料模具，底部有带开关排液口，如图 1所示。

3) 细菌及培养。

试验选用巴氏生孢八叠球菌株(Sporosarcina pasteurii)，采用平板培养基在恒温培养箱中进行活化，然后挑取单菌落于液体培养基内在恒温振荡仪中进行扩大培养，获得原菌。细菌培养所用培养基配方如下：酵母提取物20 g/L，NH₄Cl；10 g/L，MnCl₂·H₂O；12 mg/L，NiCl₂·6H₂O；24 mg/L，蒸馏水；1 000 g/L，琼脂15 g/L(配制平板培养基时需添加)，用氢氧化钠溶液将培养基pH调至8.5左右。

4) 处理液。

为了避免高浓度钙离子对细菌活性的抑制作用，反应过程中采用的处理液均为1 mol/L的氯化钙和尿素混合溶液，将处理液与菌液1:1混合后，钙离子浓度为0.5 mol/L，该浓度对细菌活性的抑制是很小的^[10]。

1.2 方法

根据MICP的反应方程式^[1]，钙离子浓度变化可以反映胶结的过程，因此本文通过监测反应过程中的钙离子浓度变化来反映实际反应过程。钙离子浓度监测采用EDTA钙离子浓度滴定法^[17]。

按照1.1节中配方制备培养基，在高压蒸汽灭菌锅中高压灭菌30 min后将培养基置于无菌操作台冷却，冷却至室温后按照1:100的比例接种细菌，置于36 ℃、100 r/min的恒温振荡仪中进行培养。培养24 h，观察到培养液变浑浊后，用电导率仪测量活性，活性满足要求后方可进行胶结试验。

首先将设计质量的粗粒土装入模具，随后将设计体积的细菌溶液和处理液按照1:1混合后灌入模具。每隔设计时间(如：0.5 h、1 h)，取0.1 mL胶结液进行钙离子浓度滴定。为了避免因颗粒存在导致取样不均匀性，取样时有颗粒组均打开模具底部排液口开关，使胶结液流淌至一容器内后再取样，随后将胶结液缓慢倒回模具，无颗粒组一部分采用以上相同方式取样，一部分原位取样，即不打开排液口取样。重复上述操作至反应基本结束。

1.3 试验设计

试验分A、B、C、D 4个组次，每组均设置无颗粒组作为对照试验，试验均在室内20 ℃左右进行。

MICP是胶结溶液与颗粒相互作用的过程，为了反映溶液特性与颗粒特性对对反应速率的综合影响，单位体积胶结液中颗粒表面积计算公式为：

$ U= \frac{{Am}}{{V}} $

(1)

式中：U表示单位体积胶结液中颗粒表面积，cm²/mL；A表示颗粒比表面积，cm²/g；V表示胶结液体积，mL；m表示颗粒总质量，g。由式(1)可以看出，U与颗粒性质、胶结液体积密切相关。当胶结液体积、颗粒总质量不变时，U随着颗粒比表面积的增大而增大，而对于同种材料而言，颗粒比表面积一般随颗粒粒径的减小而增大；当颗粒粒径、总质量不变时，U随着胶结液体积的增大而减小。基于此设定了试验组次，试验参数如表 1。

1.4 经验公式建立

参考Whiffin^[6]得到的电导率变化率和脲酶活性的经验关系，1 mS/min的电导率变化率对应11 mmol/min的尿素水解量，换算得到单位时间内尿素水解量，即经验反应速率。再根据反应方程式^[1]，在理想条件下，可认为尿素的水解的量与碳酸钙生成的量是相同的，因此通过上述经验反应速率可以建立钙离子浓度与反应时间的关系:

$ C_{\rm Ca^{2+}}=C_0-v_e×t $

(2)

式中：C_Ca²⁺表示钙离子浓度，mol/L；C₀表示初始钙离子浓度，mol/L；v_e表示经验反应速率，mol/L/h；t表示反应时间，h。v_e计算表达式^{[6-7, 10]}为：

$ ve= \frac{{p×11×60×n}}{{1\; 000×N}} $

(3)

式中：p表示电导率仪变化率，mS/min；n表示测定电导率变化率时细菌溶液的稀释倍数，本文试验中n为10；N表示实际反应溶液中对细菌溶液的稀释倍数，本试验中N为2。

2 试验结果及分析 2.1 试验结果

A、B、C、D组试验结果如图 2~5。由图 2可知，对比无颗粒组A₂和有颗粒组A₁，可以看出A₂组在整个反应过程中钙离子浓度都高于A₁，这表明颗粒的存在促进了反应的进行。反应前期反应基本上以一恒定速率进行，钙离子浓度均匀递减，在反应进行3 h以后，反应开始衰减，钙离子浓度逐渐趋于一定值。

颗粒的存在会使细菌吸附在颗粒表面，使吸附的细菌在原位反应，不断形成碳酸钙晶体。在无颗粒组中，细菌作为成核位点^[3]，在反应时由于其细胞膜表面不断胶结生成碳酸钙晶体，导致其逐渐沉积在样模底部，形成一层致密的碳酸钙层，如图 3所示。碳酸钙层的形成对尿素进入细菌内部以及碳酸根离子的排出细胞形成了障碍，从而降低了反应速率。因此在胶结液特性、外界因素一致的前提下，颗粒的存在会促进反应速率的提升。

由于同一次试验中p、n、N等变量都是恒定不变的，根据式(3)可知，同一次试验中经验反应速率是一定值，因此经验计算的钙离子浓度曲线是一条随时间递减的直线，表示钙离子浓度匀速降低。对比A₂组中的实际钙离子浓度曲线和经验计算曲线，二者并不吻合，A₂组中钙离子浓度值均高于经验计算值，说明了A₂组中生成的碳酸钙沉淀一定程度上抑制了反应的进行，而经验计算并不能体现这一影响。在加入土颗粒后，A₁组与经验计算值变得十分靠近，但经验计算值仍然无法反映试验后期反应的衰减过程。

由图 4可知，B₅组在整个反应过程中钙离子浓度都远高于B₁~B₄，颗粒的存在极大地促进了反应的进行。对比粒径相同的B₁~B₄组试样，总表面积不同，U相同，其钙离子浓度曲线基本重合，说明钙离子浓度变化并不是受颗粒单独影响，而与其所处的胶结液体积也有一定关系。取B₂、B₃组分析，B₃可以看作由2个相同的B₂组成，因而二者反应速率基本一致，因此B₁~B₄组次的反应速率基本相同。对比B₅组的钙离子浓度值和经验计算值，二者差异很大，但颗粒的加入使反应速率大幅提升。B₁~B₄组在反应开始2 h后开始衰减，但经验计算值无法反映这一衰减过程。

由表 1及式(1)可知，C组试验中，C₁~C₄组是由于胶结液体积不同导致U不同。由图 5及表(1)可知，在相同条件下，C₁~C₄组的反应速率均随着U的增大而增大。结合B组试验结果，充分说明在胶结液特性、外界因素一致的前提下，U是体现材料特性对反应速率影响的关键因素。

取C₂组与C₄组分析，C₄组胶结液体积只有90 mL，刚好淹没试样，C₂组胶结液体积为180 mL，除去淹没试样的90 mL胶结液外，剩余90 mL胶结液没有颗粒存在，根据A组结果分析，剩余90 mL胶结液反应速率一定低于有颗粒存在时的反应速率，从而使C₂组整体上的反应速率低于C₄组。可见在试样确定的情况下，过量的胶结液并不会提升反应速率。相同条件下胶结液体积越大，反应速率越慢，土颗粒不存在时，反应速率最慢。

A₂、B₅组试验的胶结液取样都是原位取样，即不打开排液口取样。为了探究取样过程对反应速率的影响，在C₅组试验中，取样时和C₁~C₄组采用相同方式，即胶结液流淌出后再取样。对比B₅、C₅组试验结果，可以看出取样方式的改变对反应也有很大的影响。

由表 1可知，在D₁~D₃组中，由于颗粒比表面积不同导致颗粒总表面积不同，导致U不同。由图 6可知，反应速率也基本呈现出U越大，反应速率越快的规律，这与Zhou等^[15]发现的规律相近。值得注意的是，D₃与D₄组并未呈现出该规律。

碳酸钙沉积现象不仅存在于无颗粒组中，在粒径较大试样中的样模底部和颗粒上部表面同样存在，并且粒径越大，沉积现象越明显。因此在D组试验中，在其他条件一致情况下，颗粒粒径越小，U越大，越多的细菌吸附在颗粒表面而不是沉积，导致反应速率越快。

按照以上结果分析，D₄组0.5~1 mm粒径的试样应当具有更大的反应速率，但是试验结果表明其反应速率与D₃组1~2 mm粒径的试样相当甚至略低，笔者分析是因为0.5~1 mm试样中颗粒孔隙尺度较小，反应胶结生成的碳酸钙沉淀堵塞了试样顶部的一部分颗粒孔隙^[6]，试验中重复倾倒胶结液时，堵塞效应使得胶结液的向下渗透的路径发生了改变，无法均匀到达每一个颗粒孔隙，从而使整体反应速率降低，且这种影响已经超过了颗粒的存在对反应速率的提升作用。

此外，D₅组中试验前2.5 h的胶结液取样都是原位取样，而2.5 h以后的取样中，取样时无颗粒组和其他试样组采用相同方式取样。结果表明，取样方式改变，对反应产生扰动后反应速率明显加快。

2.2 分析与讨论

1) 钙离子浓度变化趋势基本分为2个阶段：第1阶段为线性反应段，钙离子浓度以相对稳定的反应速率不断降低，第2阶段为衰减段，随着钙离子浓度降低，反应速率逐渐减小，趋于一不变值。但各组试验由于参数不同，拐点并不一致，因此各组线性反应段的时间也不同。A~D组反应拐点时刻分别为反应开始后3、2、2和2.5 h。取各组试验反应线性段的单位时间内钙离子浓度变化值作为实测反应速率v_m，计算公式为：

$ v_{\mathrm{m}}=\frac{C_{\mathrm{c}}-C_{0}}{t} $

(4)

式中：C_c为拐点处钙离子浓度，均为0.5 mol/L；C₀为起始钙离子浓度；t为线性反应时间段。根据式(3)、(4)可得到各组实测反应速率，从而得到U与实测、经验反应速率的关系曲线。

为便于比较，取活性相近的B、C、D组试验结果绘制成图 7。由图可知，B、C、D各组试样的反应速率总体上均随着U增大而增大，但增大速率越来越低，存在一个U临界值，对应的反应速率最大，在本文试验环境下，U临界值约为30 cm²/mL。B组中U相同，因此反应速率相近。C、D组中反应速率整体上都随着U增大而增大，但C组中是由于胶结液体积不同导致U不同，D组是由于颗粒比表面积不同导致U不同。由于各组经验反应速率均为定值，因此各组经验计算反应速率并不随U变化而变化。

2) 各组反应均存在一个明显的衰减过程，但经验关系并不能体现。为了评价经验反应速率对实际反应速率预测的准确性，做反应速率误差δ与U关系曲线。反应速率误差δ为：

$ δ= \frac{{Δv}}{{v_{\rm m}}}×100\% $

(5)

式中：δ为反应速率误差，%；Δv为反应速率差，mol/L/h，Δv计算公式为：

$ Δv=v_{\rm m}-v_{\rm e} $

(6)

由图 8可知，U对经验反应速率误差影响显著，反应速率误差随U的增大而显著降低。从本次试验结果来看，δ在3.1%~127.8%，当U大于10 cm²/mL时，δ基本小于10%。总体上表明，当U在超过某一临界值后，实测反应速率与经验反应速率比较接近，经验值能达到一定的精度，在本文试验条件下，该U临界值约为10 cm²/mL。

但需要指出的是，虽然经验计算反应速率和颗粒存在时实测反应速率在一定范围内相近，且都大于无颗粒存在时的实测反应速率，但原因是不同的。经验关系是在无钙离子情况下测定的，没有碳酸钙沉淀对反应的阻碍，细菌可以充分发挥其分解尿素的功能，因此经验公式计算所得反应速率较快。而有颗粒组与无颗粒组相比，颗粒的存在对反应速率的有利影响超过了生成碳酸钙沉淀对于反应的不利影响，使得反应速率显著提高，同时反应过程中不断地对胶结液进行循环扰动，更使得反应速率有所提升。因此试验中表现出的反应线性段反应速率实测值与经验值接近只是数值上的接近，其相对于无颗粒组反应速率加快的原因是不一样的。因此经验关系从实际意义上是不能反映颗粒存在对反应速率的影响的，但在本文试验环境下，U在超过某一临界值后经验值在数值上具有一定的参考价值。

3) 根据本文试验来看，在本文试验条件下反应开始3~4 h后钙离子浓度已经基本接近于零，但这并不代表此时是更换处理液的最佳时间，因为微生物诱导生成的碳酸钙沉淀在沉淀初期处于不定型状态，需要一定的时间进行碳酸钙晶体形式转化^[9]，而转化的条件、时间以及机理有待于进一步研究。

3 结论

1) 在胶结液特性、外界因素一致的前提下，无土颗粒存在时反应过程中形成的碳酸钙沉积层会一定程度上降低反应速率，随着土颗粒的加入会使细菌吸附在土颗粒表面，充分发挥细菌分解尿素、生成碳酸钙的胶结能力，使得反应速率显著加快。因此，土颗粒的存在有助于提高MICP的反应速率。

2) 反应速率受胶结液体积和土颗粒表面积综合影响。在相同试验环境下，随着U的增大，反应速率逐渐增大；但当U增大至某一值后，由于颗粒间孔隙堵塞效应显著增强，反应速率逐渐降低。因此，存在U临界值，其所对应的反应速率最大，在本文试验环境下，U临界值约为30 cm²/mL。

3) 实测MICP反应速率基本分为2个阶段：稳定阶段和衰减阶段。经验反应速率仅与溶液初始性质有关，在整个反应过程中为常量，不能反映反应速率的衰减过程，更不能反映颗粒存在对反应速率的影响。虽然在本文试验环境下，U在超过某一临界值后，经验值和实测值比较接近，但这仅是数值相近，两者原因截然不同，这是土颗粒存在加速反应和碳酸钙沉积抑制反应的综合体现。

本文试验中以粗粒土为主要对象，随着土颗粒的减小，MICP反应所产生碳酸钙堵塞孔隙效应逐渐增强，此时采用本文试验方法分析U对反应速率的影响受干扰显著，因此对于土颗粒较小时MICP反应速率的影响必须建立新的试验方法或评价方法(如微观分析)，这是后续的研究内容。