脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)是蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)患者最常见的并发症之一，直接影响远端脑血管灌注，严重者可导致脑梗死发生，显著增加SAH患者的病残率和死亡率^[1-3]。因此，早期识别与预防CVS发生对SAH患者远期预后具有重要意义。有研究发现SAH患者血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)表达异常，并与CVS存在一定时间相关性，提示ACE可能参与CVS发生过程^{[4, 5]}。本研究以166例自发性SAH患者为研究对象，探讨ACE基因插入(insertion, I)/缺失(deletion, D)多态性及其血清水平与CVS的相关性，为临床工作提供参考。

1 对象与方法 1.1 研究对象

连续性选择2014年10月至2017年1月于我院神经外科治疗的自发性SAH患者纳入研究，纳入标准:①年龄>18岁或≤80岁; ②SAH诊断明确，并经头颅CT/MR检查确认; ③首次发病，且由发病到住院＜24 h; ④出生并长期生活于陕西地区的汉族人，彼此无血缘关系; ⑤一般临床资料完整; ⑥患者及家属完全知情同意。排除标准:①创伤性SAH; ②病情严重，发病早期即出现脑疝、死亡; ③合并其他严重神经、精神疾病; ④合并严重肝肾功能障碍、自身免疫疾病、严重感染、恶性肿瘤、严重凝血功能障碍，或近期口服抗血小板、抗凝药物; ⑤妊娠期女性。本研究共纳入166例患者，其中男97例，女69例，平均年龄(50.2±11.4)岁。本研究通过本院伦理委员会审核批准。

所有研究对象按照有无合并CVS分为CVS组和对照组，其中CVS组72例，包括男42例，女30例，平均年龄(48.9±10.2)岁; 对照组94例，包括男55例，女39例，平均年龄(51.1±12.7)岁，两组患者性别，年龄差异均无统计学意义(χ²=2.005, P=0.157; t=0.643, P=0.521)。CVS的诊断标准:SAH发病3 d~2周内; 患者临床症状经治疗好转或稳定后再次恶化或进行性加重; 经颅多普勒(transcranial Doppler, TCD)超声检查大脑中动脉峰值平均血流速度(peak mean flow velocity, PMFV)≥140 cm/s，或大脑后动脉PMFV≥90 cm/s，并排除再出血、脑积水、感染和电解质紊乱等因素后可诊断为CVS。

1.2 研究方法 1.2.1 一般临床资料

收集所有入组患者临床资料，主要包括患者性别、年龄、体重指数、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、Fisher分级和Hunt-Hess分级等。

1.2.2 血清ACE测定

分别于入院时，及入院后第4、7、10、13天抽取外周静脉血，采用ELISA法检测患者血清ACE水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照使用说明进行操作。

1.2.3 基因组DNA提取

采集清晨空腹时外周静脉血用于实验室检查，部分样本采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因组DNA。

1.2.4 PCR扩增

PCR反应体系主要包括:上下游引物各1 μl(上游:5'-CTGGAGACCACTCC CATCCTTTCT-3';下游:5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'，均由上海生工生物技术有限公司合成)、dNTP混合物2 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、模板DNA 1 μl、10×Buffer 2.5 μl。反应条件:95℃预变性4 min，然后按照变性95℃ 20 s、退火65℃ 30 s、延长72℃ 50 s的顺序循环30周期，最后72℃延长3 min。

1.2.5 基因型判读

取PCR扩增产物进行电泳，紫外灯下观察并摄片，有且只有1条490 bp电泳带记为Ⅱ基因型，有且只有1条190 bp电泳带记为DD基因型，490 bp和190 bp电泳带同时存在时记为ID基因型，见图 1。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析处理，计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示，多组均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，两组均数比较采用t检验; 计数资料结果以构成百分比(%)表示，组间比较采用χ²检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。单因素分析P＜0.05的参数采用二分类多因素logistic回归分析法评价ACE基因多态性与SAH患者CVS的相关关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 两组患者一般临床资料比较

如表 1，本研究结果显示，CVS组患者年龄、性别、体重指数、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒等指标与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05);两组在发热、Hunt-Hess分级和Fisher分级三项指标上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 两组患者血清ACE水平动态变化

如表 2，CVS组患者入院时及入院第4、7、10、13天血清ACE水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);但两组血清ACE水平随时间推移均无显著变化(P>0.05)。

2.3 不同基因型患者血清ACE水平动态变化

如表 3，不同基因型患者入院时，及入院第4、7、10、13日血清ACE水平差异具有统计学意义(P＜0.05);但每种基因型患者血清ACE水平随时间推移均无显著变化(P>0.05)。

2.4 ACE基因I/D位点多态性与CVS的关系

ACE组和对照组比较，两组ACE基因I/D位点基因型和等位基因分布频率差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表 4。

2.5 多因素logistic回归分析

如表 5，采用二分类多因素logistic回归法分析，结果显示对于自发性SAH患者，携带ACE基因I/D位点D等位基因是发生CVS的危险因素。

3 讨论

本研究发现ACE基因I/D多态性与自发性SAH后CVS发生密切相关，携带D等位基因是CVS发生的危险因素，可显著增加CVS发病风险。

CVS的具体发生机制复杂，可能涉及炎症反应、血管舒张/收缩因子失衡、血管壁结构变化等多方面因素^{[6, 7]}。

ACE是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的重要成员之一，有研究发现SAH患者脑脊液ACE水平显著增高，并与CVS发生具有一定时间相关性，表现为出血后脑脊液ACE水平逐渐增高，于1周时达到高峰，之后逐渐降至基线水平^[4]。然而，SAH患者血清ACE水平动态变化过程目前研究尚无统一结论，多数研究结果显示SAH后血清ACE水平随时间无明显变化^[8]。但王平等^[9]研究发现SAH后血清AT Ⅱ水平立即开始逐渐增高，24 h达到高峰，1周时逐渐回落。本研究CVS和对照组血清ACE水平在发病13 d内与基线比较均无明显变化，但CVS组患者入院时基线血清ACE水平较对照组显著升高，提示SAH患者血清ACE水平可能与CVS存在一定相关性。

既往研究证实ACE基因I/D多态性与ACE生成及活性密切相关，DD基因型人群血清ACE水平最高，ID基因型次之，Ⅱ基因型最低^[10]，本研究结果与既往研究相符，携带DD基因型患者血清ACE水平在各时间点均为最高。同时，还有研究发现ACE基因I/D多态性与缺血性卒中和脑出血易感性相关^{[11, 12]}。但是，目前关于ACE基因I/D多态性与SAH易感性研究相对较少，且结论不一，与SAH后CVS相关性研究更鲜有报道。本研究结果显示ACE基因I/D多态性与自发性SAH后CVS发生密切相关，DD基因型是CVS发生的危险因素，可显著增加CVS发病风险。该结果间接说明了CVS组患者血清ACE水平较对照组明显升高的原因。另外，多因素分析结果还显示发热、高Hunt-Hess等级和高Fisher等级与SAH患者发生CVS密切相关，提示对于合并发热、高Hunt-Hess等级和高Fisher等级的自发性SAH患者，更加需要仔细评估其发生CVS的可能性，及时予以相关处理，选择更合适的治疗方案。

最后，需指出，一方面，本研究尚存在诸多不足，本研究纳入样本量较小，其结果期待多中心大样本研究证据进一步验证; 另一方面，CVS发病机制十分复杂，不仅与局部复杂多变病理生理状况相关，还可能是多基因共同表达的结果，ACE基因多态性与其他因素、其他基因相互作用的具体机制有待进一步研究。