半乳糖凝集素-3(galectin-3, Gal-3) 广泛分布于正常组织和疾病组织中，参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和分化、免疫调节、细胞黏附、炎症反应、肿瘤侵袭、转移以及细胞凋亡等^[1]。大量研究证实，Gal-3蛋白直接参与调节细胞凋亡，其具有促进细胞凋亡及抗细胞凋亡双重作用，但其在脑缺血/再灌注缺血/再灌注组(ischemia /reperfusion, I/R)损伤中的作用机制尚未见报道。同时，有研究表明，Gal-3缺乏可抑制B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, bcl-2) 的表达，促进线粒体凋亡通路主要成员Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteine aspastic acid-specific protease 3, caspase-3) 的表达变化。

基于以上原因，通过脑缺血/再灌注损伤大鼠模型，确定Gal-3是否可以通过调控bcl-2、BAX及caspase-3的表达，参与脑缺血的病理过程，从而为脑缺血的发病及治疗机制提供一定的实验依据。

1 材料和方法 1.1 实验动物、分组及给药

SPF级雄性SD大鼠18只，体重270~320 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠随机分为3组，即假手术组(sham)，假手术5 min后经侧脑室注射等容量生理盐水；缺血/再灌注组(I/R)，脑缺血5 min后经侧脑室注射等容量生理盐水；Gal-3 RNA干扰组(siRNA)，脑缺血5 min后经侧脑室注射Gal-3 siRNA 10 μg^[2]。

1.2 主要试剂及仪器

生物素标记的蛋白分子量标准(KangChen, KC-410)；HRP标记的二级抗体；Trizol试剂(Invitrogen，美国)；组织总蛋白提取试剂盒(KangChen, KC-415)；BCA蛋白质定量试剂盒(KangChen, KC-430)；KCTM化学发光试剂盒(KangChen, KC-420)；逆转录试剂盒(Invitrogen)；sybergreen I试剂盒(Invitrogen)；PCR仪(BIO-RAD)；real-time PCR仪(Applied biosystem)；NanoDrop ND-1000紫外分光光度计。

1.3 大鼠大脑中动脉阻塞模型制备

采用线栓法^[3]制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，以10%水合氯醛(350 mg/kg)对大鼠进行麻醉，仰卧位固定，颈部正中切开皮肤，暴露并分离右侧的颈总、颈内及颈外动脉。于颈内、颈外动脉的分叉处以动脉夹夹闭，将颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将尼龙线栓由颈外动脉的游离端插入到颈内动脉，深度大约为(18.5±0.5) mm，直至产生阻力感，使线头端通过大脑中动脉起始处，结扎颈内动脉用以固定尼龙线并防止出血，将切口逐层缝合，线残端留1 cm长于皮外。1.5 h后，将尼龙线拔出并进行再灌注至24 h，期间大鼠肛温保持37℃。假手术组大鼠不阻塞大脑中动脉，其他步骤同I/R组。

1.4 real-time PCR检测Gal-3、bcl-2、bax和caspase-3 mRNA表达

取各组大鼠脑皮质组织，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。使用NanoDrop^® ND-1000测定RNA A260/A280的比值范围在1.8~2.1之间。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，具体引物序列如下：

bcl-2(F:5’TGGGATGCCTTTGTGGAAC3’；R:5’CATATTTGTTTGGGGCAGGTC3’)；

caspase-3(F:5’GAGCTGGACTGCGGTATTGAG3’；R: 5’ACACGGGATCTGTTTCTTTGC3’)；

Gal-3(F:5’AGCCCAACGCAAACAGTATC3’；R:5’GGCTTCAACCAGGACCTGTA3’)；

BAX(F:5’TTTTTGCTACAGGGTTTCATCCAGG3’；R: 5’CCATATTGCTGTCCAGTTCATCTCC3’)；

GAPDH(F:5’GGAAAGCTGTGGCGTGAT3’；R:5’AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3’)；

Gal-3 siRNA^[4](F:5’-GCAAUACAAAGCUGGAUAA dTdT-3’；R:5’-PUUAUCCAGCUUUGUAUUGCdTdT-3’)。

将dNTP 2.5 μl、10×PCR缓冲液2.5 μl、MgCl2溶液1.5 μ l、Taq聚合酶1U、2× Sybergreen、Gal-3、bcl-2、caspase-3、bax或GAPDH上下游引物各1 μl及cDNA模板1 μl，加无RNA酶水补足25 μl，轻弹管底将溶液混合。按50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1min，95℃ 15 s(40个循环)；95℃ 15 s，60℃ 1 min反应条件进行real-time PCR反应。

1.5 Western blot检测Gal-3、bcl-2、BAX和caspase-3蛋白表达

按蛋白提取试剂盒说明书提取各组大脑皮质蛋白(组织称重，切小块，加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂，匀浆器匀浆，14, 000 xg预冷离心15 min)，BCA蛋白质定量试剂盒进行定量，SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，将封闭过的膜加一级抗体4℃过夜，TBST洗3次，每次5 min。分别加兔抗鼠Gal-3多克隆抗体、兔抗鼠bcl-2多克隆抗体、兔抗鼠caspase-3多克隆抗体和兔抗鼠bax多克隆抗体(稀释度为1 :3000)，4℃摇床过夜，加入HRP标记的羊抗兔二级抗体，室温摇床孵育2 h，充分漂洗，按照KCTM化学发光试剂盒说明曝光。β-actin做内参重复以上步骤。ImageJ分析软件分析特异条带灰度值。

1.6 统计学分析

数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 17.0及Graphpad 5.0统计软件，组间比较用t检验进行分析。real-time PCR结果用2-^△△CT(即表达升高或降低的倍数)表示。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 脑缺血/再灌注损伤时Gal-3对bcl-2、BAX和caspase-3 mRNA表达的影响

与sham组比较，I/R组Gal-3和bcl-2 mRNA表达均下调(P < 0.05)；BAX及caspase-3 mRNA表达均上调(P < 0.05)。与I/R组比较，siRNA组Gal-3及bcl-2 mRNA表达均下调(P < 0.05)；BAX及caspase-3 mRNA表达均上调(P < 0.05)。见表 1、图 1。

2.2 脑缺血/再灌注损伤Gal-3对bcl-2、BAX和caspase-3蛋白表达的影响

与sham比较，I/R组Gal-3及bcl-2蛋白表达均下调(P < 0.05)；BAX及caspase-3蛋白表达均上调(P < 0.05)。与I/R组比较，siRNA组Gal-3及bcl-2蛋白表达下调(P < 0.05)；而BAX及caspase-3蛋白表达上调(P < 0.05)。见表 2、图 2。

3 讨论

我国最新的全国公民死亡原因调查结果显示，脑缺血已成为我国公民致死、致残最主要的疾病之一^[5]。我国现存脑血管病患者700余万人，其中约有80%~85%的脑血管病患者为脑缺血^[6]。

脑缺血发病机制非常复杂，目前研究认为，与脑缺血发生发展相关的病理机制包括：能量耗竭、兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、炎症和细胞凋亡等。脑缺血再灌注损伤会产生大量活性氧，引发一系列的事件，包括细胞凋亡及坏死^[7]。而细胞凋亡是脑缺血的一个突出特点，在延迟梗死中起着重要的病理作用^[8]。

大量研究证实，Gal-3蛋白直接参与调节细胞凋亡。其具有促进细胞凋亡及抗细胞凋亡双重作用。Huang等^[9]发现人脑垂体腺瘤组织中Gal-3及Bcl-2的mRNA及蛋白表达均明显升高，认为Gal-3可能通过与Bcl-2协同产生抗凋亡作用。Fukumori等^[10]采用人前列腺癌LNCaP细胞系，转染Gal-3，之后发现，用抗癌药物处理后，Gal-3间接抑制细胞色素c的释放和caspase-3的激活；表明Gal-3可能抑制抗癌药物诱导的细胞凋亡。Yang等^[11]通过人白血病T细胞转染Gal-3后发现，Gal-3可能通过bcl-2相关细胞死亡抑制通路成为抑制细胞凋亡的调节子。Okamura等^[12]发现慢性阻塞性肾小管慢性损伤细胞内Gal-3可抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的活力、抑制肾小管上皮细胞的凋亡，从而可通过抑制细胞凋亡而保护肾小管慢性损伤。以上研究均表明，Gal-3具有一定的抑制细胞凋亡的作用。而本研究发现，大鼠I/R后，脑皮质中Gal-3及bcl-2 mRNA及蛋白表达下调；BAX及caspase-3 mRNA及蛋白表达上调；而Gal-3 RNA干扰后，Gal-3及bcl-2 mRNA及蛋白表达下调更显著，BAX及caspase-3 mRNA及蛋白表达上调更显著。表明Gal-3可能通过上调bcl-2、下调caspase-3及BAX mRNA及蛋白的表达，参与脑缺血/再灌注损伤的病理过程。