癫痫发病的危险因素有多种。其发病机制比较复杂，有研究表明，炎性损伤参与了癫痫持续状态的发生^[1]。以往有研究表明，腺苷A1受体可通过激活后抑制谷氨酸的表达发挥抗癫痫作用^{[2, 3]}。但当癫痫频繁发作，腺苷浓度降低，A1受体结合能力减弱，致使腺苷的抗癫痫作用减弱。现已有研究表明，腺苷A2A受体的结合能力高于A1受体，且作用与A1的作用相反，可通过阻断A2A受体发挥脑保护作用^[4.5]。但阻断A2A受体是否能够在癫痫持续状态(SE)模型中也发挥脑保护作用鲜有报道。本研究成功复制氯化锂-毛果芸香碱SE模型，旨在探讨腺苷A2A受体阻断剂SCH58261对SE的作用及具体机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

SPF级雄性Wistar大鼠，体重200~300 g，温度18~25℃，自由饮食水，适应性喂养1周后进行实验。大鼠随机分为对照组、模型组及A2A受体阻断剂组。

1.2 药品与试剂

兔抗JNK多克隆抗体、兔抗p-JNK多克隆抗体、兔抗p-p38单克隆抗体、小鼠抗p38单克隆抗体、小鼠抗p-Erk1/2单克隆抗体和兔抗Erk1/2单克隆抗体均购自美国Cell Signal公司；SCH58261购自英国Tocris Cookson公司；其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 SE模型建立

除对照组外，其余大鼠均给予腹腔注射氯化锂3 mmol/kg，18~24 h后腹腔注射毛果芸香碱50 mg/kg·40~60 min模型点燃后，参照改良后Racine分级法进行癫痫强度的评价，若达到5级发作视为点燃成功，发作持续15 min后给予阿托品，40 min后给予地西泮及6%水合氯醛交替腹腔注射直至发作控制^[10]。A2A受体阻断剂组在氯化锂-毛果芸香碱注射前15 min予腹腔给药(SCH58261 0.05 mg/kg)，对照组给予同等剂量生理盐水。所有实验动物在点燃成功持续发作后40 min予地西泮及水合氯醛终止发作，对照组在同时间点给予上述药物。并于发作终止后24 h留取标本。

1.4 海马神经元Nissl染色

三组实验动物在24 h后采用取-70℃冰箱中预冷异戊烷灌注取脑，-20℃冰箱保存备用。采用Nissl染色液进行染色、脱水、透明及封片等后期处理。采用BI-2000型图像分析系统进行神经元的观察，在光学显微镜(×400) 视野下观察各组海马组织Nissl染色阳性神经元的损伤情况，随机选择3个视野进行阳性神经元的计数，取平均值。

1.5 Western blot检测

冰上剥离海马，提取总蛋白，测定蛋白浓度后，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭后，加一抗、二抗孵育，DAB显色，扫描胶片，使用美国Gene Genius公司凝胶成像分析系统分析JNK、p-JNK、P38、p-P38、ERK和p-ERK光密度值，计算p-JNK/JNK、p-P38 /P38和p-ERK /ERK比值。

1.6 统计学分析

数据分析采用SPSS 15.0软件，计量数据以均数±标准差(x±s)来表示。各组间差异分析采用单因素方差分析。P < 0.05代表差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Nissl染色结果

尼氏染色的结果显示，对照组染色最为清晰，可见Nissl小体大而数量多，呈蓝紫色；模型组染色最模糊，Nissl小体的数量减少，甚至消失；A2A受体阻断剂组介于二者中间。光镜下进行神经元计数，结果显示，对照组、模型组及A2A受体阻断剂组双侧海马CA3区正常形态神经元计数分别为158.6±8.4、59.8±7.4和123.4±5.0，模型组神经元计数显著低于对照组，差异具有统计学意义(P < 0.05)，A2A受体阻断剂组神经元计数显著高于模型组，差异具有统计学意义(P < 0.05)。说明阻断剂明显改善了海马区神经损伤情况，药物对癫痫持续状态下海马神经元损伤有抑制作用。见图 1、图 2。

2.2 Western blot检测结果

Western blot分析显示，三组中JNK、P38和ERK表达差异无统计学意义。对照组中p-JNK、p-P38和p-ERK表达量较少，模型组中p-JNK、p-P38和p-ERK表达量明显增多，A2A受体阻断剂组中p-JNK和p-P38表达量较模型组少，p-ERK表达量与模型组无明显差异。

相对光密度值分析示，p-JNK46/JNK46在对照组、模型组、A2A受体阻断剂组中分别为0.15±0.02、0.53±0.06和0.24±0.03，组间差异有统计学意义(P < 0.05)；p-JNK54/JNK54在三组中分别为0.15±0.02、0.53±0.06和0.24±0.02，组间差异有统计学意义(P < 0.05)。p-P38/P38在对照组、模型组和A2A受体阻断剂组中分别为0.41±0.03、1.20±0.06和0.71±0.04，组间差异有统计学意义(P < 0.05)。p-ERK42/ERK42在对照组、模型组和A2A受体阻断剂组中分别为0.11±0.03、1.04±0.09和1.05±0.05；p-ERK44/ERK44在对照组、模型组和A2A受体阻断剂组中分别为0.12±0.03、1.03±0.05和1.04±0.05；模型组和A2A受体阻断剂组明显高于对照组(P < 0.05)，但两组之间表达无差异。见图 3~图 8。

3 讨论

腺苷在信号转导中作为G蛋白偶联受体发挥作用，与Gs偶联，有抑制腺苷酸环化酶(AC)，降低cAMP水平的作用，参与神经元兴奋等重要生命活动^[6]。在神经退行性疾病中，腺苷A2A受体的拮抗剂表现出减轻损害的作用^[7]。腺苷A2A受体的亲和力较强，此受体被阻断或是受到损伤时，能够减轻脑部的损伤情况，改善神经功能^{[8, 9]}。腺苷A2A受体主要分布在基底节区，近年来研究发现A2A受体在与癫痫相关的新皮质和边缘系统也有分布。在病理条件下，A2A受体表达会有变化。研究证实，在帕金森病患者体内，A2A受体的表达上调，而且分布也有变化^[10]。反复发作的癫痫模型中，A2A受体的表达也明显上调，说明A2A受体在相关疾病(如癫痫和帕金森病)中有更大的研究价值。

本课题组前期研究已经显示，在氯化锂-毛果芸香碱SE模型中，A1受体表达及结合力降低，而A2A表达及结合力增加，两方面导致癫痫发作不易控制，脑神经元损伤严重^[11]。本实验即在此基础上，推测A2A受体水平升高会加重癫痫持续状态，造成脑部损伤，如果阻断A2A受体可能抑制癫痫发作以及对海马神经元损伤起保护作用。前期研究证实，在杏仁核点燃癫痫模型中，SCH58261发挥作用的有效浓度在0.005 mg/kg到0.5 mg/kg之间(腹腔注射)，本实验参照以往实验^[12]，选取有效浓度0.05 mg/kg进行干预。本实验选用点燃后的大鼠，并且A2A受体的结合能力增强，密度也增加，以增加A2A受体阻断剂与受体结合概率，充分表达抑制性。

本研究结果显示，与对照组相比，氯化锂-毛果芸香碱SE模型中双侧海马CA3区神经元缺失明显，细胞数量明显少于A2A受体阻断剂组和对照组，说明A2A受体阻断剂组的腺苷A2A受体阻断剂SCH58261可以减少神经元损伤，证实腺苷A2A受体阻断剂SCH58261可以减轻SE模型中海马神经元损伤。丝裂原活化蛋白激酶系统(MAPKs)是体内重要的信号转导系统，参与了细胞的生长、分化、死亡等多种过程，实验中，我们也检测了JNK、p38、ERK及其磷酸化蛋白的表达情况^{[13, 14]}。Western blot检测SE模型中双侧海马p-JNK、p-P38和p-ERK表达明显增多，药物组中p-JNK和p-P38的表达较模型组在一定程度上减少，说明药物能够抑制p-JNK及p-P38表达，进一步抑制了相应的下游信号通路，参与SE模型中神经元保护作用。

本研究发现A2A受体阻断剂有改善癫痫持续状态，减轻神经损伤，但A2A受体阻断剂的有效浓度尚需要进一步研究，有研究表示这类阻断剂有一定的不良反应，A2A受体发挥作用可能存在其他的通路，例如之前已有研究表明，癫痫的发作与谷氨酸的释放有关，与其相关的信号通路和蛋白质表达值得进一步的探讨。

综上所述，SCH58261(0.05 mg/kg，腹腔注射)对大鼠氯化锂-毛果芸香碱SE模型有一定的脑保护作用。其作用机制可能是通过抑制p-JNK及p-P38信号通路实现。