国际神经病学神经外科学杂志  2016, Vol. 43 Issue (2): 112-118

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王进昆, 高锋, 谢姝姮, 陈雪菲, 王崇谦, 汤志伟
WANG Jin-Kun, GAO Feng, XIE Shu-Heng, CHEN Xue-Fei, WANG Chong-Qian, TANG Zhi-Wei
百日咳毒素减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型炎症反应的机制研究
Mechanism of action of pertussis toxin in alleviating inflammatory response in the mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis
国际神经病学神经外科学杂志, 2016, 43(2): 112-118
Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2016, 43(2): 112-118

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收稿日期: 2016-03-05
修回日期: 2016-04-25
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王进昆, 高锋, 谢姝姮, 陈雪菲, 王崇谦, 汤志伟. 百日咳毒素减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型炎症反应的机制研究[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2016, 43(2): 112-118.
WANG Jin-Kun, GAO Feng, XIE Shu-Heng, CHEN Xue-Fei, WANG Chong-Qian, TANG Zhi-Wei. Mechanism of action of pertussis toxin in alleviating inflammatory response in the mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Journal of International Neurology and Neurosurgery, 2016, 43(2): 112-118.
百日咳毒素减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型炎症反应的机制研究
王进昆, 高锋, 谢姝姮, 陈雪菲, 王崇谦, 汤志伟     
昆明医科大学第一附属医院神经外科, 云南省昆明市 650032
收稿日期: 2016-03-05; 修回日期: 2016-04-25
基金项目: 国家自然科学基金项目(81360204);云南省卫生科技计划项目(2014NS178)
作者简介: 王进昆(1960-),男,学士,主任医师,教授,硕士生导师,主要从事脑血管病的研究。E-mail:13708849879@163.com 。
通讯作者: 汤志伟(1980-),男,博士,主治医师,讲师,硕士生导师,主要从事脑血管病的研究。E-mail:tangzhiwei7755@hotmail.com 。
摘要: 目的 探讨百日咳毒素(PTx)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的作用及机制。方法 将C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、EAE组和PTx治疗组,每组12只。EAE组和PTx治疗组用MOG 35-55诱导EAE模型。PTx组于建模后第7天给予腹腔注射1000 ng的PTx。随后观察两组临床症状,组织学染色评价炎症反应和脱髓鞘改变,并观察VEGF和血管新生现象,并用Western blot检测脊髓VEGF和Collagen IV的整体水平。在体外,用PTx刺激原代培养的神经元,评价PTx对在体外对神经元VEGF表达的影响。结果 PTx能减轻EAE模型的炎症反应和脱髓鞘改变,在大脑PTx将炎症评分从(3.4±0.55)分降至(1.2+0.45)分,P<0.01;脱髓鞘评分从(3.6+0.55)分降至(1.4+0.55)分,P<0.01。在脊髓 PTx将炎症评分从(3.6+0.55)分降至(1.0+0.71)分,P<0.01;脱髓鞘评分从(4.2+0.84)分降至(1.4+0.55)分,P<0.01。Western blot检测显示,与正常对照组比较,EAE组VEGF下降49.0%(P<0.01),Collagen IV下降36.0%(P<0.01);PTx治疗后,与EAE组比较,VEGF上升59.5%(P<0.01),Collagen IV上升45.0%(P<0.01)。体外实验显示,PTx治疗24 h后VEGF在神经元上的表达增加,与正常对照相比,100 ng/ml组上调34.6%(P<0.01),400 ng/ml组上调76.9%(P<0.01)。结论 PTx 可上调神经元内源VEGF的表达和血管新生现象,继而在EAE模型中起保护作用。
关键词： 百日咳毒素     多发性硬化     血管内皮生长因子     神经元     血管新生     小鼠    
Mechanism of action of pertussis toxin in alleviating inflammatory response in the mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis
WANG Jin-Kun, GAO Feng, XIE Shu-Heng, CHEN Xue-Fei, WANG Chong-Qian, TANG Zhi-Wei     
Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China
Abstract: Objective To investigate the role and mechanism of action of pertussis toxin (PTx) in the mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).Methods C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group, EAE group, and PTx treatment group, with 12 mice in each group. In the EAE group and PTx treatment group, EAE model was established using MOG 35-55, and the mice in the PTx treatment group were given 1000 ng intraperitoneally injected PTx at 7 days after modeling. The clinical symptoms were observed in these two groups. Histological staining was used to evaluate inflammatory response and changes in demyelination and observe vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiogenesis. Western blot was used to measure the levels of VEGF and collagen IV. PTx was used to stimulate primary cultured neurons in vitro to assess the in vitro effect of PTx on VEGF expression in neurons.Results PTx alleviated the inflammatory response and demyelination in EAE model, and in the brain, PTx treatment reduced the inflammation score from 3.4±0.55 to 1.2±0.45 (P<0.01) and the demyelination score from 3.6±0.55 to 1.4±0.55 (P<0.01). In the spinal cord, PTx treatment reduced the inflammation score from 3.6±0.55 to 1.0±0.71 (P<0.01) and the demyelination score from 4.2±0.84 to 1.4±0.55 (P<0.01). The results of Western blot showed that compared with the normal control group, the EAE group showed a 49.0% reduction in VEGF (P<0.01) and a 36.0% reduction in Collagen IV (P<0.01); compared with the EAE group, the PTx treatment group showed a 59.5% increase in VEGF (P<0.01) and a 45.0% increase in collagen IV (P<0.01). The in vitro experiment showed that at 24 hours after PTx treatment, the expression of VEGF in neurons was upregulated; compared with the normal control group, the 100 ng/ml group showed a 34.6% increase in the expression of VEGF, and the 400 ng/ml group showed a 76.9% increase.Conclusions PTx can upregulate endogenous VEGF in neurons and angiogenesis, and thus exerts a protective effect in EAE model.
Key words: pertussis toxin     multiple sclerosis     vascular endothelial growth factor     neuron     angiogenesis     mouse    

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种发生于中枢神经系统的炎症性脱髓鞘疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究该疾病的基本模型。文献报道和我们的前期工作发现，大剂量百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)可减轻EAE模型的临床症状[1]，但具体机制尚不完全清楚。

研究表明血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管新生(angiogenesis)可能在EAE和MS的病理生理过程中发挥作用。有的报道提示，在EAE模型中VEGF和血管新生现象增加，而有的认为减少[2-4, 17-19]。目前VEGF和血管新生在EAE发病机制中的作用依旧不清楚。Lu等[5]报道PTx可以在体外脑微血管内皮细胞系及体内诱导产生血管新生现象。此外，有证据表明，VEGF具有神经保护作用，它能刺激神经元生长和存活[6, 7]。为此，我们提出假设，PTx能增加VEGF的表达进而诱导血管新生产生，同时这一作用对EAE有保护作用。

1 材料和方法 1.1 实验动物和EAE模型诱导

将雌性的C57BL/6小鼠(6～8周,Taconic Laboratory,New York,USA)随机分为3组：正常对照组、EAE组和PTx治疗组，每组12只。

EAE的诱导方法参考文献资料[1]，对EAE组和PTx治疗组的小鼠给予皮下注射200 μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55;M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-V-V-H-L-Y-R-N-G-K,Bio-synthesis Inc.Lewisville,TX)，MOG35-55溶解于50 μl完全弗氏佐剂乳胶剂，该乳胶剂含0.5 mg加热灭活的结核分枝杆菌(CFA,Difco Laboratories,Detroit,MI)。在免疫诱导当天和和第48小时，分别腹腔注射PTx 200 ng(List Biological laboratories Inc.)。在免疫诱导后第7天，给PTx治疗组小鼠再额外腹腔注射1000 ng PTx。

1.2 神经功能检测

神经功能检测实验由实验观察者在双盲情况下给每只小鼠进行评价。采用5分法标准等级量表对EAE模型进行临床分级评分：0分=无症状；1分=尾巴瘫痪；2分=单侧后肢无力；3分=不完全双侧后肢瘫痪伴或不伴部分前肢无力；4分=完全后肢瘫痪伴部分前肢无力；5分=濒死状态或死亡[1, 8]。对3组小鼠每天进行神经功能检测，并记录分值。

1.3 组织学检测

建模第19天，取小鼠脊髓和大脑。用H&E染色和Luxol fast blue/periodic acid Schiff reagent(LFB/PAS)分别来评价大脑和脊髓的炎症反应和脱髓鞘改变。免疫组织化学染色检测VEGF及Collagen IV的表达[11]。

1.3.1 半定量系统评价大脑和脊髓的炎症反应和脱髓鞘改变

采用组织学打分半定量系统评价大脑和脊髓的炎症反应和脱髓鞘改变的程度。计数浸润渗透到脊髓及大脑的炎症细胞来评价炎症反应的程度。数码图片用Axoplan显微镜(Zeiss,Thornwood,NY)采集，明亮视野下放大400倍。在H&E染色中炎症细胞浸润渗透的严重程度根据下面的标准来打分[9]：0分=无炎症反应；1分=炎症细胞仅渗透到血管及脑膜周围；2分=炎症细胞轻度渗透到实质部分(每个区域1～10个细胞)；3分=炎症细胞中度渗透到实质部分(每个区域11～100个细胞)；4分=炎症细胞重度渗透到实质部分(每个区大于100个细胞)。

1.3.2 用Luxol fast blue染色法对脱髓鞘程度进行评价

用Luxol fast blue染色的方法对多聚甲醛固定过的脑和脊髓切片进行染色，并在双盲条件下根据量表对脱髓鞘程度进行评价[10]：0分=正常白质；1分=轻度局部脱髓鞘；2分=多个部位脱髓鞘；3分=汇合成片的血管周围或软膜下脱髓鞘；4分=大片的血管周围或软膜下脱髓鞘，包括半边脊髓或大脑实质内有炎症细胞浸润渗透；5分=广泛的血管周围和软膜下脱髓鞘，包括脊髓或大脑实质内有炎症细胞浸润渗透。每只小鼠至少计数6个部位。

1.3.3 免疫组织化学的方法检测VEGF和Collagen Ⅳ

免疫组织化学的方法检测VEGF(NG1651636,Millipore Corporation,Billerica,MA)和Collagen Ⅳ(ab19808,Abcam Inc.,Cambridge,MA)在各组小鼠脊髓和大脑的表达情况。用免疫荧光双染检测VEGF在神经元上的表达情况，用NeuN(MAB377,Millipore Corporation,Billerica,MA)抗体来标记神经元。实验设置阴性对照和阳性对照，以排除抗体及染色过程中造成的假阳性或假阴性。

1.4 Western blot蛋白定量分析

建模第19天，收集脑和脊髓组织，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。取相同剂量蛋白进行Western blot。电泳及转膜，分别加入一抗VEGF和Collagen IV，4℃缓慢摇动孵育过夜。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(7074,Cell signaling technology;Danvers,MA)，室温下孵育1 h后显色。结果与内参β-actin(sc-47778,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)进行比较，结果以百分比的形式表示。

1.5 体外实验

培养原代神经元细胞：取新生第一天小鼠，无菌条件下，在显微镜下取脑，分离出双侧皮质，置于神经元培养基(Invitrogen Corporation,CA)中。将皮质组织剪碎，Papain消化液(Worthington,Biochemical,Lakewood)，37℃消化20 min，持续震荡(150 rpm)。加入10% FBS液(Sigma,St.Louis,MO)终止消化过程，70 μm过滤器过滤。将所得混合液离心3 min，转速1500 rpm，弃上清液。用含有0.5%左旋谷氨酸(L-glutamine)和2%无血清B27(Invitrogen Corporation,CA)的神经元培养基，重新形成细胞悬液。将细胞植入到Poly-D-lysine预处理过的培养皿。放置于37℃，5% CO2的培养箱继续培养，每3～4 d更换一次培养基。

细胞培养的第7天，PTx治疗组原代神经元细胞予PTx处理，干预浓度分别为100 ng/ml和400 ng/ml。治疗24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞。用VEGF(NG1651636,Millipore Corporation,Billerica,MA)和Map2(3-1103,Gainesville,FL)抗体双标记VEGF和神经元，检测VEGF在神经元上的表达。用VisionWorks LS图像获取和分析软件(Image Acquisition and Analysis Software,UVP,LLC,CA)测定并计算VEGF表达的平均密度，作为VEGF的表达量进行比较。

1.6 统计学分析及图片处理

数据的记录、处理、运算、作图和统计学分析应用Microsoft Excel 2007、SPSS13.0软件进行处理。计量资料以均数±标准差(x±s)的形式表示，记数资料用卡方检验进行分析，均数用成组设计的两样本均数的配对t检验或非配对t检验，P<0.05为有差异统计学意义。图像资料采用Adobe Photoshop CS(Adobe,Inc.)软件进行编辑和处理。

2 结果 2.1 PTx治疗能减轻EAE模型的临床神经功能损伤、炎症反应和脱髓鞘改变

建立EAE模型后，小鼠在12 d左右开始出现临床症状，主要表现为肢体功能障碍，且逐渐加重。在第19天时，临床评分为(3.83±0.39)分，而PTx治疗组的EAE小鼠基本没有临床症状(图 1A)。

组织学检测提示，在EAE组的脊髓和大脑，可见大量炎症细胞在血管周围和实质内浸润渗透，且脱髓鞘改变明显，而PTx治疗组炎症反应程度和脱髓鞘改变显著减轻(图 1B、图 1C)。

图 1 PTx能减轻EAE模型的临床症状，炎症和脱髓鞘反应。A：采用MOG 35-55诱导EAE模型后，小鼠表现出明显的运动功能障碍，而PTx治疗后可明显缓解这种症状(n=12)。B：H&E染色显示诱导EAE模型后大量炎症细胞浸润，而PTx治疗可减轻炎症细胞浸润(n=5，×400)。C：Luxol快速蓝染色提示诱导EAE模型后，出现明显的脱髓鞘改变，而PTx治疗可缓解脱髓鞘改变(n=5，×400)。
图选项

在大脑PTx将炎症评分从(3.4±0.55)分降至(1.2±0.45)分，P<0.01；脱髓鞘评分从(3.6±0.55)分降至(1.4±0.55)分，P<0.01。在脊髓，也可看到相似的治疗效果，PTx将炎症评分从(3.6±0.55)分降至(1.0±0.71)分，P<0.01；脱髓鞘评分从(4.2±0.84)分降至(1.4±0.55)分，P<0.01(表 1)。

表 1 EAE组和PTx治疗组的炎症评分和脱髓鞘评分比较
(x± s)
炎症(H&E)脱髓鞘(Fast Blue)
大脑脊髓大脑脊髓
EAE组3.4±0.553.6±0.553.6±0.554.2±0.84
PTx治疗组1.2±0.451.4±0.551.0±0.711.4±0.55
P值0.00010.00020.00020.0002
表选项
2.2 PTx治疗可以增加VEGF表达和血管新生

在EAE组中，脊髓灰质和大脑皮质的VEGF和Collagen IV表达较正常对照组下降，而PTx治疗后，在这些区域VEGF和Collagen IV表达明显上调(图 2A、图 2B)。尽管在EAE组的炎症细胞渗透和脱髓鞘部位，VEGF的表达和血管新生现象增加。但Western blot检测结果显示，与正常对照组相比，VEGF下降49%(P<0.01)，Collagen IV下降36%(P<0.01)。而PTx治疗后，与EAE组相比，VEGF上升59.5%(P<0.01)，Collagen IV上升45%(P<0.01)(图 2C)。

图 2 PTx能EAE模型的VEGF表达和血管新生。A：PTx可增加EAE模型的VEGF表达(n=5，×400)。B：Collagen IV抗体染色提示PTx可增加EAE模型的血管新生(n=5，×400)。C：Western blot显示EAE模型的VEGF和Collagen IV的表达下降(n=4；*与正常对照组比较，P<0.05)，而PTx可增加EAE模型的VEGF和Collagen IV的表达(n=4；*与EAE组比较，P<0.05；**与EAE组比较，P<0.01)。
图选项
2.3 PTx治疗可以增加神经元VEGF表达并减少神经元凋亡

采用VEGF和NeuN抗体双染，来检测神经元VEGF的表达情况。结果显示，诱导EAE后，VEGF阳性的神经元细胞较正常对照组有所减少，但差异无统计学意义。而PTx治疗后，将脊髓灰质区的VEGF和NeuN双阳性细胞从64±11个/mm2上调到188±25个/mm2(P<0.01)，在大脑则从87±15个/mm2上调到408±67个/mm2(P<0.01)(图 3A、图 3B)。采用Caspase3和NeuN抗体双染来检测神经元的凋亡情况，结果显示，正常组Caspase3和NeuN双阳性细胞数为5±5个/mm2，EAE组为70±10个/mm2，PTx治疗组为21±5个/mm2，与EAE组相比差异具有统计学意义(P<0.01)(图 3C、图 3D)。

图 3 PTx能上调EAE模型的神经元VEGF的表达和减少神经元的凋亡。A和B：VEGF和NeuN抗体双染提示PTx可增加EAE模型神经元VEGF的表达(n=5，×200)，半定量分析显示在大脑和脊髓，PTx治疗后，表达VEGF神经元的数量增加(n=5；**与EAE组比较，P<0.01)。C和D：Caspase3和NeuN抗体双染提示PTx可减少EAE模型神经元的凋亡(n=5，×200)，半定量分析显示，诱导EAE模型后神经元凋亡增加(n=5；**与正常对照组比较，P<0.01)，而PTx治疗可减少神经元的凋亡(n=5；**与EAE组比较，P<0.01)。
图选项
2.4 体外实验显示PTx增加VEGF在神经元上的表达

为了进一步观察PTx能否在体外增加神经元上VEGF的表达，我们培养了原代神经元细胞。在细胞培养的第7天，用100 ng/ml和400 ng/ml两个浓度级别的PTx刺激神经元。结果显示，PTx治疗24 h后VEGF在神经元上的表达增加，与正常对照组相比较，100 ng/ml组上调34.6%(P<0.01)，400 ng/ml组上调76.9%(P<0.01)(图 4)。

图 4 PTx在体外能增加神经元VEGF的表达。A：VEGF和MAP2抗体双染原代培养神经元细胞(×200)。B：半定量分析显示PTx可增加体外神经元VEGF的表达，且和浓度成正相关(n=10；*与正常对照组比较，P<0.05；**与PTx100 ng/ml组比较，P<0.05)。
图选项
3 讨论

早期的研究显示，当用小鼠脊髓匀浆组织溶于完全弗氏佐剂中来诱导EAE模型时，PTx可以增加模型的成功率和加重神经功能损伤症状[12]。后来的研究显示PTx能破坏血脑屏障，防止自身反应T细胞抗原产生，刺激抗原呈递细胞(APCs)，不可逆地抑制第二信使和影响信号通路[13-15]。所有的这些结果都在解释PTx帮助诱导EAE模型的可能机制。最近，我们和其他研究者的结果显示，PTx对EAE有治疗作用，无论是单次大剂量还是反复多次小剂量给药都有治疗和保护作用[1, 16]。尽管这些发现是全新的并能引起人们兴趣的，但其中的机制尚不清楚。

我们的研究发现，诱导小鼠EAE模型后，在小鼠脊髓和大脑的白质区域发生严重的炎症反应和脱髓鞘改变，但PTx腹腔注射治疗可显著减轻白质区域的炎症反应和脱髓鞘改变。我们发现在EAE模型中，VEGF和血管新生现象是下降的，而PTx治疗能逆转这种现象，并显著升高脊髓和大脑灰质区域的VEGF和血管新生现象，且能减轻神经元的凋亡。在体外实验中，我们发现，PTx能增加原代神经元VEGF的表达，并和剂量呈正相关。据此，我们认为VEGF和血管新生现象在EAE模型中起保护作用，是PTx在EAE模型中起保护作用的机制之一。

VEGF和血管新生现象在EAE模型中的变化报道结果不一致，有的报道提示，VEGF和血管新生现象增加，而有的认为减少[2-4, 17-19]。究其原因，一方面是检测的时间点和检测方法不同[18]；另一方面，是由于检测局部还是整体造成的。Tham等[17]和Proescholdt等[4]都用豚鼠的MBP肽在Lewis大鼠中诱导EAE模型，Tham等的结果显示在脊髓灰质和腰段脊髓匀浆组织中VEGF的表达是下降的，而Proescholdt等发现VEGF在EAE炎症部位(白质)是增加的。谭书伟等[30]报道，多发性硬化的患者较正常人更易患者缺血性脑血管病，提示在多发硬化患者中枢系统血管新生现象减少可能。我们的结果显示VEGF和血管新生现象在EAE病变部位(白质)是增加的，但这种增加是局部的，与炎症反应相关的，并没有改变VEGF和血管新生现象在EAE模型中总体的降低。

Lu等[5]研究结果显示，在体外PTx能诱导大脑微血管内皮细胞血管新生现象，在体内也能诱导血管新生现象。有报道显示，PTx能诱导内皮细胞产生一氧化氮(NO)[20]。而NO有助于血管新生现象的产生[21]。我们的研究结果显示，当PTx治疗后，EAE模型临床症状和炎症反应都明显减轻，组织学检测显示在脊髓和大脑的灰质区，VEGF和血管新生现象都增加，且匀浆组织检测总体水平也增加。提示上调VEGF和血管新生现象是PTx保护EAE模型的机制之一。

研究显示VEGF具有神经保护作用并能刺激神经元生长和增加存活能力[6, 7, 22]。在运动系统疾病中，神经元的退变与神经元内源性的VEGF表达下调是相关的，如肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)和Kennedy疾病[23-27]。已有报道显示，用基因修饰的方法使VEGF的表达下调会导致运动神经元退行性改变[24, 25]。有意思的是，Smith等[28]报道在EAE模型的脊髓中，不仅仅是髓质还包括神经元都是淋巴细胞攻击的目标，并随之退行性改变。已有证据表明，在EAE模型中，神经元细胞减少[28, 29]。我们发现PTx治疗显著的上调神经元上VEGF的表达，并且PTx治疗能防止EAE模型中炎症反应和脱髓鞘改变的发生。这些结果提示，上调神经元的VEGF表达在EAE模型中起神经保护作用。

总的来讲，我们的研究结果发现PTx治疗可上调神经元内源性VEGF表达和血管再生现象，能减轻EAE模型的炎症反应和脱髓鞘改变，以及减少神经元凋亡，在EAE模型中起保护作用。

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