2018, Vol. 42
2. 510655 广州, 中山大学附属第六医院核医学科;
3. 510080 广州, 中山大学附属第一医院核医学科;
4. 510080 广州, 中山大学附属第一医院放疗科
2. Department of Nuclear Medicine, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510655, China;
3. Department of Nuclear Medicine, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China;
4. Department of Radiation Oncology, The First Affiliated Hospital, SunYat-sen University, Guangzhou 510080, China
近几十年来，原发性肝癌的全球发病率逐渐上升，早期发现和诊断对其治疗及预后至关重要。与大多数恶性肿瘤相比，肝癌的诊断可以完全依据影像学表现。然而，推荐用于病灶成像的增强CT或MRI的灵敏度较低，分别为76%和61%[1]。18F-FDG PET可为肝脏手术、移植和姑息治疗提供有价值的预后信息，但在肝细胞癌的诊断中作用有限[2-3]。乙酸盐和胆碱能显像剂对18F-FDG显像具有重要的互补作用[4]。虽然11C-乙酸盐的摄取机制尚不清楚，但最新研究发现大多数前列腺肿瘤脂肪酸合成代谢活跃，推测这是由于肿瘤中11C-乙酸盐摄取增加，即以乙酸盐为底物合成短链脂肪酸[5]。11C-乙酸盐在肝癌成像方面显示出很好的前景，但是11C的半衰期（20.4 min）短，限制了它的广泛应用。为此，开发了18F-氟乙酸（18F-fluoroacetic acid, 18F-FAC）作为11C-乙酸盐的替代物。18F-FAC的缺点在于其被骨骼大量吸收，放射性示踪剂的脱氟特性限制了它的使用[6-7]。因此，需要开发或寻找新的PET示踪剂以克服现有的缺点或补充现有的示踪剂。因此，我们制备了18F-氟丙酸（18F-fluoropropionic acid, 18F-FPA），探讨18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取情况和在荷肝癌肿瘤模型中的显像效果，并对其摄取机制进行了初步探索。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器人肝癌SK-Hep 1细胞系来自中国科学院细胞库（上海），无特定病原体级雄性Bclb/c裸鼠，4~6周龄，体质量20~25 g，购自广州中山大学医学院实验动物中心。4，7，13，16，21，24-六氧-1，10-二氮双环[8.8.8]二十六烷（K222）购自法国ABX公司；乙腈和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Aldrich公司；甲基-2-溴丙酸乙酯购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；奥利司他（Orilistat）购自美国Sigma-Alrich公司；5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸（5-Tetradecyloxy-2-furoic acid, TOFA）购自美国Cayman Chemical公司；其余试剂均为国产分析纯或化学纯。Sep Pak QMA、C18 plus柱购自美国Waters公司；micro PET/CT显像仪购自德国Bruker公司，由中山大学中山医学院实验平台提供。
1.2 细胞培养和动物模型的建立人肝癌SK-Hep 1细胞培养基使用DMEM，采用含10%胎牛血清，于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养基每周例行更换3次，选择处于指数增长的肿瘤细胞用于实验。所有实验均在中山大学动物实验中心批准的方案下进行，常规消毒后每只Bclb/c裸鼠腋窝皮下注射5×106个/mL肿瘤细胞100 μL，其中含细胞培养悬液50 μL、基质胶50 μL。荷人肝癌SK-Hep 1小鼠在无特定病原体级环境中培养，食物充足。每周测量2次体质量和肿瘤体积。待肿瘤体积长到500~1000 mm3时进行实验。
1.3 18F-FPA的合成18F-FPA的合成是基于文献[8]和既往的合成方法。回旋加速器通过180（p，n）18F核反应生产得到18F离子，18F离子通过QMA柱俘获后用K222溶液淋洗到反应瓶中；利用氮气在116 ℃加热条件下除去溶剂；将甲基-2-溴丙酸乙酯加入含有[18F]KF/K222的反应瓶中，在密闭的反应管内加热至100 ℃并持续15 min。冷却后，用8 mL水将中间体挂在HLB柱子上。用2 mol/L的NaOH通过HLB固相萃取小柱，室温下水解5 min。用1 mL灭菌水通过HLB-Al2O3-SCX柱将产品洗至产品瓶中，调节pH值至中性或弱酸性，用生理盐水配成溶液通过0.22 μm无菌滤膜后使用。使用高效液相色谱测定18F-FPA的放射性化学纯度。
1.4 体外实验 1.4.1 细胞结合实验将人肝癌SK-Hep 1细胞悬液于实验前一天铺于24孔板中（1×107个/孔），将细胞培养基倒掉，用PBS清洗细胞2次，加入18F-FPA（约2 mL，0.074 MBq/孔），于37℃、5%CO2细胞培养箱分别孵育5、30、60、90和120 min后，用PBS冲洗细胞2次，再加入1 mol/L的NaOH 500 μL，裂解20 min，收集细胞裂解液，用γ计数仪测细胞放射性活度。结果以平均值±标准差表示，每次实验重复4次。
| $ 细胞摄取率 = \frac{细胞摄取剂量}{注入总剂量} \times 100\% $ |
将人肝癌SK-Hep 1细胞悬液接种于24孔板，于37℃、5%CO2培养箱中孵育1 d，将细胞培养基倒掉，用PBS清洗2次，然后将细胞悬液分为对照组和实验组，对照组加入200 μL PBS；实验组共分为5组，分别加入不同浓度梯度（25、50、100、200、400 μmol/L）的抑制剂奥利司他或TOFA 200 μL，孵育30 min后加入18F-FPA（约2 mL，0.074 MBq/孔），孵育60 min后用PBS冲洗细胞2次，用1 mol/L NaOH 500 μL，裂解20 min，收集细胞裂解液，用γ计数仪测细胞放射性活度。结果以平均值±标准差表示，每次实验重复4次。实验组得出的数据与对照组相比，观察在不同浓度的抑制剂条件下细胞对18F-FPA的摄取抑制情况。
1.5 荷人肝癌SK-Hep 1小鼠micro PET/CT显像将荷人肝癌SK-Hep 1小鼠禁食4 h，小鼠在注射放射性示踪剂前用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，并在整个研究过程中保持麻醉状态，然后经尾静脉给予100~120 μL 18F-FPA溶液，约3.70~4.44 MBq。给药60 min后行全身microPET/CT显像。先行15 min的静态PET扫描，然后用CT扫描对病变部位进行校正和定位。同一只荷人肝癌SK-Hep 1小鼠，完成18F-FPA显像后放置24 h，在与18F-FPA同样的注射剂量、扫描条件下给小鼠尾静脉注射18F-FDG进行显像。使用Albira PET系统和PMOD 3.7版软件进行图像重建，由2名核医学科医师在肿瘤和肌肉组织上绘制ROI，获得肿瘤及组织器官的每克组织百分注射剂量率（ID%/g值），并对所获得的数据进行分析。
1.6 肿瘤组织苏木精-伊红法染色PET/CT显像完成后，处死荷人肝癌SK-Hep 1小鼠，分离肿瘤组织，用冷的PBS溶液冲洗细胞3次，部分肿瘤组织用4%甲醛溶液浸泡，然后用石蜡切片，每片厚5 μm，脱蜡、水化，苏木精染色5 min后伊红染色2 min，在光学显微镜下观察肿瘤细胞形态。
1.7 统计学分析应用SPSS18.0软件进行统计学分析。所有数据均用平均数±标准差（x±s）表示，计数数据符合正态分布且方差齐，18F-FPA和18F-FDG在肿瘤中的放射性摄取率的比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 18F-FPA合成结果18F-FPA的合成在40 min内完成，经高效液相色谱分析测定，产物的放射性化学纯度>95%，比活度>37 GBq/μmol，合成最终产率为（45±2）%。
2.2 体外细胞实验结果18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取率从5 min的（1.3±0.4）%上升到120 min的（4.6±0.2）%，30~60 min放射性摄取增加速度最快（图 1）。不同浓度梯度抑制剂奥利司他和TOFA分别对人肝癌SK-Hep 1细胞摄取抑制的实验结果见图 2。由图 2可见，随着抑制剂浓度的增高，人肝癌SK-Hep 1细胞的放射性摄取率表现出逐渐降低的趋势。与对照组比较，当抑制剂奥利司他和TOFA的浓度分别为400 μmol/L时，人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率分别下降了（40.3±4.0）%和（26.0±6.0）%。
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图 1 不同时间点人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-氟丙酸的摄取率 Figure 1 The cellular uptake rate of 18F-fluoropropionic acid by human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 cells at different time points |
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图 2 不同浓度抑制剂奥利司他和TOFA对18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取抑制作用 Figure 2 Different concentrations of Orilistat and TOFA presented a inbibitive effect on of 18F-fluoropropionic acid in SK-Hep 1 cells 图中，A：SK-Hep 1细胞中不同浓度脂肪酸合成酶抑制剂奥利司他对18F-FPA的摄取抑制；B：SK-Hep 1细胞中不同浓度乙酰辅酶A合成酶抑制剂TOFA对18F-FPA的摄取抑制。FPA：氟丙酸；TOFA：5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸。 |
荷人肝癌SK-Hep 1小鼠注射18F-FPA后行microPET/CT显像结果见图 3。由图 3可见，静脉注射18F-FPA 60 min后，microPET/CT显像显示在荷人肝癌SK-Hep 1小鼠中表现出快速且准确的肿瘤定位，相应的肿瘤摄取值为（8.15±0.13）%ID/g，肿瘤/肝放射性比值为1.63±0.26。18F-FDG PET/CT显像中，肿瘤摄取值为（3.25±0.50）%ID/g，肿瘤/肝放射性比值为1.09±0.21。18F-FPA的肿瘤/肝放射性比值高于18F-FDG，差异有统计学意义（t=4.055，P=0.047）。
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图 3 18F-FDG和18F-FPA在荷人肝癌SK-Hep 1小鼠中的micro PET/CT显像图 Figure 3 micro PET/CT imaging of 18F-FDG and 18F-fluoropropionic acid in human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 mice 图中，红色箭头指向肿瘤部位；FDG：氟脱氧葡萄糖；FPA：氟丙酸；Min：最小；Max：最大；%ID/g：每克组织百分注射剂量率。 |
人肝癌SK-Hep 1细胞肿瘤组织病理图见图 4。图中可见大量异性细胞，证明成功建立了肿瘤动物模型。
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图 4 人肝癌SK-Hep 1细胞肿瘤组织病理图（苏木精-伊红染色，×200） Figure 4 Histopathology of SK-Hep 1 tumor tissue(HE, ×200) |
物质代谢异常是恶性肿瘤的重要标志，除了已知的糖酵解外，恶性肿瘤会有脂质代谢紊乱的表现[9-10]。放射性核素标记的小分子，如葡萄糖、乙酸酯、FAC已被广泛用于各种肿瘤的检测，包括肝癌、前列腺癌和乳腺癌等[11-13]。18F-FDG PET可为肝脏手术、移植和姑息治疗提供有价值的预后信息，但其在肝癌诊断中的作用有限[16]。11C-乙酸酯和11C-胆碱PET对肝细胞肝癌的诊断有较高的灵敏度，在18F-FDG PET/CT中联合11C-乙酸酯和11C-胆碱显像可提高诊断原发性肝癌的整体灵敏度，但也存在一些缺点和局限性。本研究对短烷基羧酸18F-FPA进行了实验研究，结果表明，18F-FPA合成简便，产率高，是一种非常有前景的肿瘤PET显像剂。本研究结果与以往研究结果相符合[15-18]。
丙酸钠、钾和钙盐通常被广泛用于食品添加剂。代谢研究表明，丙酸可作为脂肪酸、糖原、氨基酸等合成的前体。有研究结果显示，丙酸可取代乙酸，成为心脏和肿瘤细胞首选的能量基质[18]。丙酸首先由线粒体丙酰基-辅酶A合成酶催化转变为丙酰基辅酶A，这是脂肪酸代谢的第一个共同步骤[19]。在本研究的抑制细胞实验中，我们推断18F-FPA可能有类似于18F-FAC的代谢机制，参与脂肪酸代谢。奥利司他和TOFA分别抑制脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶[20-22]。奥利司他可以特异性地抑制脂肪酸合成酶，它对不同的肿瘤细胞的增殖有潜在的抑制作用，并可抑制肿瘤的生长[23-25]。TOFA对肝细胞、大鼠肝脏或雄性大鼠肝脏的脂肪酸合成有抑制作用，降低内源性脂肪酸从而对细胞膜磷脂组分产生影响。已有研究证明，TOFA对肺癌、结肠癌和前列腺癌细胞均有细胞毒性[26-27]。在本研究中，脂肪酸合成关键酶抑制剂能够不同程度地抑制18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取，证明18F-FPA的摄取参与脂肪酸代谢途径。
本研究中，18F-FPA的体外细胞摄取及荷人肝癌SK-Hep 1小鼠PET/CT显像结果表明，18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中具有较高地摄取，且可清晰地显示肿瘤。与传统显像剂18F-FDG相比，18F-FPA具有更好的显像效果，是一种具有前景的肿瘤PET/CT显像剂。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 赵竞负责现场试验、数据的获取与分析、论文的撰写；张占文、马慧负责现场试验、数据的分析；聂大红、蒋宁一负责论文的审阅；刘生、唐刚华负责命题的提出、方法的建立、论文的审阅。
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