2018, Vol. 42
2. 366000, 福建省三明市第二医院核医学科;
3. 361102, 厦门大学分子影像暨转化医学研究中心;
4. 350001 福州, 福建医科大学附属协和临床医学院
, Huang Jianquan2, Wang Liangliang1, Jiang Yizhen1, Guo Zhide3, Ma Chao1, Su Fu1
2. Department of Nuclear Medicine, the Second Hospital of Sanming in Fujian Province, Sanming 366000, China;
3. Center for Molecular Imaging and Translational Medicine, Xiamen University, Xiamen 361102, China;
4. Union Clinical Medical College of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China
位于线粒体外膜的相对分子质量为18 000的转运蛋白（translocator protein, TSPO），曾被称为外周的苯二氮卓类受体（peripheral benzodiazepine receptor, PBR），是在进化上具有高度保守性的转运蛋白家族成员之一，主要位于肾上腺、睾丸、卵巢等细胞的线粒体外膜上，介导类固醇的合成[1]。在中枢神经系统炎症中，TSPO高表达于激活的小胶质细胞和星形胶质细胞[2]。近年的研究结果显示，在外周组织炎症中，TSPO也高表达于巨噬细胞和单核细胞[3-4]，这表明TSPO可作为参与炎症反应的免疫细胞显像的靶点。目前，在TSPO显像中主要是用11C或18F标记TSPO配体行PET显像，如11C-（R）-PK11195、11C-PBR28、11C-DAA1106、18F-FEPPA、18F-PBR06和18F-DPA-714等[5]，且有些已进入临床应用。与发射正电子的放射性核素11C和18F相比，发射单光子的放射性核素99Tcm具有价格较低廉，来源、运输方便，半衰期长，操作方便，使用范围较广等优点，且SPECT较PET便宜、普及，因此，研发新型99Tcm标记的TSPO靶向的分子探针具有较重要的临床价值。本研究以具有与TSPO较高亲合力的新型配体CB86[6]为母体，借助其表面的氨基偶联双功能螯合剂DTPA获得DTPA-CB86，进行99Tcm标记后获得新型探针99Tcm-DTPA-CB86，行左踝关节炎症小鼠Micro SPECT/CT显像，并研究其在体内的分布情况，现报道如下。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器99Mo/99Tcm发生器购自北京原子高科股份有限公司；CB86由苏新辉课题组与武汉大学药学院洪学传课题组合作制备，并已纯化、鉴定[6]；DTPA购自生工生物工程（上海）股份有限公司；CRC-25R型放射性核素活度计为美国CAPINTEC公司产品；WIZARD 2480型γ计数仪为美国珀金埃尔默仪器公司产品；Dionex Ulti-Mate 3000型高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）仪为美国Thermo Scientific公司产品；FM-2000型锝分析仪为北京东方圆通科技发展有限公司产品；Sep-Pak C18 Plus固相萃取柱（简称C18色谱柱）为美国Waters公司产品；nanoScan型SPECT/CT仪为匈牙利Mediso Medical Imaging System公司产品；DMEM培养基购自美国Gibco BRL公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；小鼠巨噬细胞RAW264.7由厦门大学生命科学学院俞春东课题组赠送；BALB/c小鼠由厦门大学实验动物中心提供（4~5周龄，雌性，体重18~20 g）。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 99Tcm-DTPA-CB86的制备向溶解有50 mg CB86的二甲基亚砜溶液中加入200 mg DTPA，在20℃下于转速为1200 r/min的磁力加热搅拌器上避光反应30 h，用C18柱纯化，得到DTPA-CB86。取1 mL高锝酸钠洗脱液（约370 MBq）加入200 μL DTPA-CB86中，再加入20 μL新鲜配制的SnCl2，置于振荡模块上100℃避光反应约30 min，冷却至室温。取出反应液，以生理盐水为展开剂，用HPLC测定标记产物的标记率。将上述反应液通过C18柱，以2 mL PBS（pH值7.4）为淋洗液进行纯化，将纯化后的反应液用上述同样的方法测定标记产物的放化纯度。取100 μL纯化后的反应液99Tcm-DTPA-CB86置于1 mL PBS中，室温放置，分别在1、2、4 h后取出反应液，用上述同样的方法测定99Tcm-DTPA-CB86的稳定性。
1.3 体外细胞摄取实验按文献报道方法，在37℃、5% CO2培养箱中常规培养RAW264.7细胞[7-9]。待细胞生长至对数生长期，用0.25%胰酶消化，将RAW264.7细胞悬液铺于24孔板中（2×105个/孔），于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜并分成两组，一组为未抑制组，另一组为抑制组，每组设3个复孔。先将99Tcm-DTPA-CB86用无血清的DMEM培养基稀释成1.11×10-1 MBq/mL。在未抑制组中加入100 μL 1.11 × 10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86；在抑制组中同时加入100 μL 1.11×10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86和10 μg未标记的DTPA-CB86，上述各孔用无血清培养基补充总体积至1 mL。将两组放置在37℃、5%CO2培养箱中培养，温育的时间点均为0.5、2、3和4 h。将孔板中所有的培养基完全吸出，然后加入0.5 mL冰冷的PBS洗2次，向所有孔板中加入1 mL 1 mol/L NaOH，室温下放置5~10 min。然后，用细胞刮刀轻刮孔板底部，使细胞完全脱离，吸取孔板内所有溶液和细胞，放入离心管中，用γ计数仪测定细胞的放射性计数（即反应管）以及总T管和空白管的放射性计数（各3支）。细胞摄取率= [（反应管计数-空白管计数）/总T管计数]×100%，绘制出细胞摄取曲线。
1.4 体外细胞释放实验细胞按文献[10]报道方法培养，将细胞悬液铺于24孔板中（2×105个/孔），每孔加入100 μL 1.11×10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86共同培养，放入37℃、5%CO2培养箱中培养4.5、5.5、7和8 h。在每个时间点上，将孔内的细胞培养基吸走丢弃，用冷的PBS冲洗细胞2次，再加入1 mL 1 mol/L NaOH裂解细胞，收集于离心管内。将收集有细胞裂解液的离心管在γ计数仪上测定细胞的放射性计数（即反应管）以及总T管和空白管的放射性计数（各3支）。细胞摄取率=[（反应管计数-空白管计数）/总T管计数]×100%，绘制出细胞摄取曲线，间接反映99Tcm-DTPA-CB86从细胞的释放情况。
1.5 99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布取体重为18~20 g的BALB/c雌鼠，按文献报道方法于左下足跖皮内注射100 μL弗氏佐剂，4周时左踝关节出现炎症肿胀，视为造模成功，即可备用[11]。采用直接抽样方法选取体重相近、左踝关节中度红肿的模型鼠12只，分为3组，每组4只，经尾静脉注射100 μL、0.37 MBq 99Tcm-DTPA-CB86，并于注射后不同时间点（0.5、1.5和3 h）处死裸鼠，取心、肝、脾、肺、肾、骨、肌肉、胃、肠和左踝关节炎症组织等主要脏器及组织，测量其质量及放射性计数，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g），以及左踝关节炎症组织与血液（arthritic ankle to blood，A/B）、左踝关节炎症组织与正常肌肉（arthritic ankle to muscle，A/M）的放射性比值。
1.6 左踝关节炎症小鼠Micro SPECT/CT显像采用直接抽样方法选取体重相近、左踝关节中度红肿的模型小鼠6只，分为未阻断组和竞争性抑制组，每组3只。未阻断组小鼠经尾静脉注射100 μL 3.7 MBq 99Tcm-DTPA-CB86；竞争性抑制组小鼠经尾静脉注射100 μL 3.7 MBq 99Tcm-DTPA-CB86和300 μg未标记的DTPA-CB86。两组小鼠均用5%的水合氯醛经腹腔麻醉，俯卧位固定于鼠板上，分别于注射0.5、1.5和3 h时行Micro SPECT/CT显像，使用平行孔准直器，将小鼠放置于视野中心，进行Micro SPECT断层扫描成像。然后进行CT扫描，通过电脑重建后得到短轴、水平长轴及垂直长轴的小鼠SPECT/CT融合图像。
1.7 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，所得数据均以均数±标准差（x± s）表示。采用Kolmogorov-Smirnov test（柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验）分析数据是否符合正态分布（P > 0.1为符合正态分布标准），用Levene检验分析数据是否符合方差齐性（sig >0.05为符合方差齐性），对符合正态性分布及方差齐性的数据采用t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 99Tcm-DTPA-CB86的制备结果经HPLC分析99Tcm-DTPA-CB86具有较高的标记率[（95.86 ±2.45）%]和放化纯度[（97.45 ± 0.69）%]。稳定性实验结果显示，99Tcm-DTPA-CB86在室温下的PBS溶液中稳定性良好，放置4 h后其标记率仍>90%。
2.2 体外细胞实验结果细胞摄取实验结果如图 1所示，小鼠RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取率在0.5 h为（28.45 ± 1.56）%，3 h时达到最高峰[（36.45 ± 2.18）%]，4 h时摄取率虽然有所下降，仍保持在较高水平[（35.63 ± 2.21）%]。在加入过量未标记的DTPA-CB86时，RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取明显下降，且随时间的延长而逐渐下降，与未阻断组相比，细胞摄取下降差异具有统计学意义（t=6.217，P < 0.05）。细胞释放实验结果如图 2所示，RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取随着时间的延长而减少，4.5 h时的摄取率为（33.31±2.34）%，8 h时为（19.32±2.01）%，减少了13.99%。
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图 1 RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）-CB86的摄取曲线(n=3) Figure 1 In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3) |
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图 2 RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）-CB86的摄取曲线(n=3) Figure 2 In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3) |
尾静脉注射示踪剂后，除了左踝关节炎症组织外，99Tcm-DTPA-CB86在各组织器官中的放射性分布随着时间的延长逐渐下降（表 1）。左踝关节炎症组织的放射性分布0.5 h时为（1.33±0.16）%ID/g，3 h时为最高值（2.35 ± 0.10）%ID/g；肝脏0.5 h时为最高值（5.56 ± 0.76）%ID/g，3 h时仍有较高的摄取，为（2.14 ± 0.23）%ID/g；血液中0.5 h时为（0.78 ± 0.07）%ID/g，3 h时为（0.56 ± 0.09）%ID/g。A/B和A/M的放射性比值随时间的延长逐渐增高，0.5 h时分别为（1.71 ± 0.05）和（1.32 ± 0.43），3 h时为（4.19 ± 0.21）和（3.01 ± 0.16）。
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表1 99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布[x± s（%ID/g）]（n= 4） Table 1 Biodistribution for 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis[x± s %ID/g)] (n = 4 for each group) |
左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后Micro SPECT/CT显像结果如图 3、图 4所示。未阻断组注射99Tcm-DTPA-CB86后0.5 h时左踝关节炎症部位可见放射性分布，且随时间的延长逐渐增浓，3 h时炎症部位显像最清晰（图 3），而正常组织的放射性分布随时间的延长逐渐减淡；竞争性抑制组始终未见明显的炎症部位显影（图 4）。
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图 3 未阻断组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图（方框示左踝关节炎症） Figure 3 Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the unblocked group at various times after injection (box showing left arthritis) |
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图 4 竞争性抑制组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图（方框示左踝关节炎症） Figure 4 Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the blocked group at various times after injection (box showing left arthritis) |
CB86是一种新型TSPO拮抗剂，其IC50（半抑制浓度）（1.2 nmol/L）比TSPO特异性拮抗剂PK 11195（2.2 nmol/L）低[12]，这表明CB86对TSPO的特异性较强。CB86分子上带有氨基，且对温度和pH值有较高的耐受性，适合在特异性结合位点上进行化学修饰，且其在连接显像或治疗的药效基团后仍对TSPO有很高的亲和性。Musacchio等[13]报道在含有紫杉醇PEG-PE（聚乙二醇磷脂酰乙醇胺）微球上修饰CB86（13.6 μmol/L）能大大增强紫杉醇的抗癌效果。TSPO作为线粒体外膜的重要组成部分，参与线粒体膜渗透性转换孔的开放，调控细胞的凋亡[1]。CB86分子不能直接用于99Tcm标记，需引入双功能螯合剂，DTPA在较低的配体浓度下即对99Tcm或111In等金属核素有很高的标记率[14]。本研究中笔者先将CB86与DTPA偶联，制成DTPA-CB86，再进行99Tcm标记获得99Tcm-DTPA-CB86，且经放射性HPLC结果证实放化纯度较好。另外，99Tcm-DTPA-CB86的体外稳定性较好，放置4 h未出现放化纯度降低，有利于进行远距离配送。
体外细胞研究结果显示：小鼠RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA-CB86的特异性摄取率在3 h时达到最高峰[（36.45 ± 2.18）%]，但同时加入过量未标记的DTPA-CB86后，细胞的摄取率显著下降；RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取随着时间的延长而略有减少，4.5 h时摄取率为（33.31 ± 2.34）%，8 h时为（19.32 ± 2.01）%，减少13.99 %，这表明99Tcm-DTPA-CB86可以特异性地与小鼠RAW264.7巨噬细胞的TSPO结合，且亲和力高，外排少。
99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布和Micro SPECT/CT显像的研究结果表明，显像剂99Tcm-DTPA-CB86在小鼠体内的稳定性尚好，随时间延长左踝关节炎症部位仍有较高摄取，而正常组织如肝、血液、肌肉等的摄取逐渐降低，提高了A/B和A/M的放射性比值以及炎症的检出率。注射后0.5 h时左踝关节炎症部位已略见显影，3 h时炎症部位摄取仍可达（2.35 ± 0.10）%ID/g，这表明99Tcm-DTPA-CB86在炎症部位中的清除率较慢且停留时间较长，有利于炎症的显像。肝、血液、肌肉中的放射性随时间延长逐渐减低，A/B和A/M的放射性比值分别从0.5 h时的（1.71 ± 0.05）和（1.32 ± 0.43）增高至3 h时的（4.19 ± 0.21）和（3.01 ± 0.16），这表明99Tcm-DTPA-CB86在血液、肌肉等非炎症组织中的清除率较快（主要从肝脏代谢），A/B和A/M的放射性比值随时间延长逐渐增高，炎症显像更清晰，提示99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠模型中的靶向性良好，且在体内的停留时间长。在竞争性抑制实验中各时间段均未见炎症显影，未标记DTPA-CB86明显抑制了99Tcm-DTPA-CB86与炎症巨噬细胞的TSPO的结合，这表明显像剂99Tcm-DTPA-CB86能够与TSPO特异性结合。
综上所述，我们成功制备的99Tcm-DTPA-CB86可与巨噬细胞特异性结合，且经标记后保留了生物学活性。小鼠体内分布及SPECT/CT显像结果表明，其有望成为一种应用于关节炎症的SPECT显像的分子显像剂。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 刘鹏、董文涛负责研究过程的实施；苏新辉负责研究命题的提出、设计和论文撰写；黄剑全、王亮亮、蒋怡臻负责研究过程的数据采集和分析统计；郭志德、马超、苏福负责研究命题的提出、研究思路和实验步骤的设计等。
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