放射性肠损伤(radiation enteritis,RE)是盆腔、腹腔等肿瘤进行放疗后常见的并发症,肠道正常组织对射线的耐受性较肿瘤组织差,放疗可造成正常组织的放射性损伤,形成RE,其发生率可达5%~17%[1-2]。RE的发病机制复杂,目前仍无有效的临床治疗手段。角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)从属于成纤维细胞生长因子家族(FGFs),参与组织器官发育、促进细胞分化、增殖及创伤愈合[3],具有抗凋亡作用,在肿瘤的发生、发展中起重要作用[4]。研究表明,KGF预防给药可以明显降低辐射引起的小肠组织损伤[5]。而关于电离辐射作用后对小鼠十二指肠组织KGF基因是否有影响以及KGF对十二指肠放射损伤修复的分子机制还需进一步研究。我们通过研究电离辐射作用后小鼠十二指肠组织KGF表达的变化及其对电离辐射作用后结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因和凋亡相关基因Bcl-2表达的影响,进一步揭示KGF在防治RE中的分子机制,为其预防及治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器KGF(重庆富进生物医药有限公司);动物组织总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);Prime ScriPtTM RT reagent Kit和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ实时荧光定量PCR试剂(大连宝生物工程有限公司)。60Co治疗机(GWGP-80,中国核动力研究院)。
1.2 实验动物分组及处理SPF级昆明小鼠,雌雄各半,6~8周龄,体重26~28 g,购于中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心,生产许可证号:SCXK(京)2014-0013,饲养于中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室。
将实验动物按照随机数表法分为对照组、照射组和治疗组,每组10只,雌雄各半。治疗组于照射前2 d及照射后3 d腹腔注射KGF,给药剂量为6 mg/kg,对照组和照射组仅注射生理盐水。
1.3 动物照射对照组不给予照射,照射组与治疗组均接受腹腔8 Gy照射。照射源为60Co治疗机,照射野为全腹(胸骨剑突至耻骨联合),源皮距80 cm,剂量率为0.678 Gy/min。
1.4 病理切片的制作照射后第15天,将各实验组小鼠空腹12 h后颈椎脱臼处死,解剖小鼠取出完整的十二指肠组织,4%甲醛溶液固定1周后,经无水乙醇脱水、石蜡包埋后制作RE病理切片,苏木精-伊红染色法进行染色。
1.5 实时荧光定量PCR检测完整的十二指肠组织加入裂解液研磨,提取总RNA,反转录cDNA,利用实时荧光定量PCR分析KGF对CTGF、Bcl-2基因mRNA表达水平的影响。对照组基因表达量为1,以△△Ct法进行相对定量分析各个基因mRNA水平。
1.6 统计学处理实验数据采用统计学分析软件IBM SPSS Statistics V21.0进行分析。计量资料符合正态分布,以x±s表示;两组间差异采用独立样本t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 病理结果光镜下观察,对照组十二指肠肠绒毛、隐窝结构完整,排列整齐(图 1中A);照射组十二指肠病理结果出现绒毛萎缩、变短或脱落,肠腔内充满坏死脱落的组织,腺窝可见较多凋亡细胞(图 1中B);治疗组肠绒毛组织结构完整,腺窝可见少量凋亡细胞(图 1中C),这表明KGF能够有效减少放射性损伤。
KGF有修复受损黏膜的功能,我们利用8 Gy γ射线照射小鼠腹腔后,十二指肠组织中KGF基因表达量显著增高,是对照组的38倍(图 2),差异有统计学意义(t=-125.55,P < 0.05),这表明机体通过KGF的高表达来修复电离辐射造成的损伤。
电离辐射可进一步通过炎性相关因子引起肠上皮细胞的损伤,治疗组CTGF基因表达与照射组相比显著下调,差异有统计学意义(t=4.89,P < 0.05);但照射组、治疗组中CTGF基因表达量均高于对照组,差异有统计学意义(t=-6.55,-3.10,均P < 0.05),结果见图 3。
利用荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2,结果显示,KGF给药后凋亡相关基因Bcl-2表达量与照射组相比显著上调,差异有统计学意义(t=-20.96,P < 0.05),且照射组与治疗组中Bcl-2基因表达量均显著高于对照组(t=-6.69、-40.65,均P < 0.05),这表明KGF对细胞凋亡起到了抑制作用,结果见图 4。
KGF从属于成纤维细胞生长因子(FGFs)家族,又称FGF-7,参与组织器官发育、促进上皮细胞生长增殖及创伤愈合、具有抗凋亡作用,在肿瘤的发生、发展中起重要作用[3-4]。通常KGF在损伤修复过程中大量表达,外用能有效地促进创面再上皮化[6]。我们检测了电离辐射照射后小鼠十二指肠组织中KGF基因mRNA表达水平,结果显示,电离辐射能够诱导实验动物自身KGF基因表达水平显著升高,这是因为在辐射刺激下,成纤维细胞通过分泌KGF促进细胞的增殖、迁移以及黏膜上皮细胞的再生,以减轻放射损伤。Krishnan等[7]给予葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠道损伤小鼠KGF治疗,显微镜下也观察到隐窝完整、上皮轻度缺损以及炎症浸润减轻,说明KGF具有改善和缓解溃疡,减轻损伤的功效。同时,我们通过病理切片能够观察到,给予KGF的治疗组肠绒毛组织结构完整,而照射组肠绒毛萎缩、变短、脱落明显,这也说明KGF能够有效降低放射性损伤,进一步揭示KGF在放射性十二指肠损伤防护作用中的分子机制。
CTGF通过激活Ras/Raf/ERK等信号通路进一步促进成纤维细胞分裂增殖及胶原沉积,最终促进纤维化的发生与发展[8]。CTGF同时具有诱导凋亡的作用,还可以专一介导转化因子β1的促纤维化作用[9-10]。有文献报道,CTGF作为介导转化因子β1的下游效应介质,在生理状态下几乎不表达,而在肺纤维化过程中表达明显升高,且与肺纤维化程度呈正相关[11]。同时CTGF还可以通过自分泌的方式增强肠道肌纤维母细胞的活化,引起辐射剂量依赖的胶原合成增加促进纤维化[12]。从研究结果发现,电离辐射能够诱导CTGF基因相对表达量升高,而KGF治疗组与照射组相比,CTGF基因表达显著下调,说明KGF能够有效抑制肠损伤的纤维化进程,对RE起到有效的防护作用。刘小菁等[13]利用RNA干扰技术来抑制CTGF基因的表达,发现能够明显抑制人肺成纤维细胞的增殖及表型转化。通常在生理状态下,CTGF几乎不表达,而在纤维化过程中其表达水平明显增高,且与纤维化程度呈正相关[11, 14],而抑制CTGF的表达能阻止纤维化系列反应进程[15-16]。因此,CTGF的表达水平能够有效地反映KGF对肠损伤的修复情况。
正常肠上皮细胞存在凋亡现象,通过清除衰老细胞来维持上皮的完整性,是肠上皮细胞更新的生理过程[17]。Bcl-2基因是重要的凋亡相关基因,能够抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡。本研究结果显示,γ射线照后15 d小鼠十二指肠组织Bcl-2基因表达显著升高,这可能是由于细胞进入恢复期,细胞凋亡逐渐降低导致的。病理结果也显示,照射组肠绒毛处可见凋亡细胞,通过高表达Bcl-2基因来抑制凋亡。KGF具有抗凋亡的作用,可通过抑制凋亡相关因子的表达和增加Bcl-2的表达来减少细胞凋亡。Wildhaber等[18]研究KGF对凋亡的作用,发现营养缺乏致肠上皮细胞凋亡的小鼠中,KGF降低了细胞的凋亡,且上调了Bcl-2 mRNA的表达。同时我们发现,治疗组与照射组相比,Bcl-2基因表达显著上调,同时,光镜下观察治疗组只可见少量凋亡细胞,这主要是由于KGF对凋亡的抑制作用造成的。
综上所述,KGF能够有效降低生物放射性损伤,并可能通过下调CTGF基因修复电离辐射造成的损伤,通过调节凋亡相关基因Bcl-2的表达水平来降低细胞凋亡。我们认为KGF可减轻辐射引起的肠损伤,在RE防护中起到了一定作用,提示KGF有望成为新的放射防护药物,为RE的预防及治疗提供了实验依据,但深入的分子机制仍需进一步研究。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展,不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 原雅艺负责主要实验的实施、数据分析及论文撰写、修订;任越、张睿凤负责病理实验;刘红艳、董娟聪、张忠新负责基因相关实验;左雅慧负责研究命题的提出、实验设计等。
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