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  分子影像学杂志  2017, Vol. 40 Issue (2): 210-213  DOI: 10.3969/j.issn.1674-4500.2017.02.24
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引用本文 

黄超有, 吴德华, 韩铮, 朱珊珊 . 敲除TPX2基因可以降低乳腺癌干细胞活性及增加放疗敏感性[J]. 分子影像学杂志, 2017, 40(2): 210-213. DOI: 10.3969/j.issn.1674-4500.2017.02.24

作者简介

黄超有,E-mail: cjbabay@126.com

文章历史

收稿日期:2017-02-06
敲除TPX2基因可以降低乳腺癌干细胞活性及增加放疗敏感性
黄超有1, 吴德华2, 韩铮1, 朱珊珊1     
1 广州市番禺区何贤纪念医院乳腺甲状腺外科,广东  广州  511400;
2 南方医科大学南方医院放疗科,广东  广州  510515
摘要目的 研究TPX2基因对乳腺癌干细胞活性及放疗敏感性的影响。方法 使用蛋白质印迹法检测TPX2基因在乳腺癌细胞及组织中的表达情况。使用RT-PCR检测TPX2基因在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达差异。使用慢病毒干扰载体建立稳定低表达TPX2蛋白的乳腺癌细胞。平板克隆、MTT试验验证TPX2对乳腺癌细胞生长能力的影响。流式细胞仪检测敲除TPX2之后对乳腺癌细胞凋亡比率的影响。检测CD44阳性细胞比例、肿瘤球形成能力以及侧群细胞比例,验证敲除TPX2之后对乳腺癌干细胞活性影响。结果 TPX2基因在乳腺癌组织及细胞中表达水平明显升高(P<0.05)。敲除TPX2之后,可以使乳腺癌细胞生长能力减弱并促进细胞凋亡。TPX2敲除后,可以降低乳腺癌干细胞活性及提高放疗敏感性。 结论 TPX2为促进乳腺癌细胞生长的一个癌基因,其可通过提高乳腺癌干细胞活性来影响乳腺癌细胞的放疗敏感性。
关键词:TPX2    肿瘤干细胞    放疗敏感性    乳腺癌    

近年来,随着乳腺外科手术技术和妇科肿瘤学的不断发展,乳腺癌的预后仍不容乐观,目前常规手术结合放化疗的综合治疗,其5年生存率只有54.5%[1]。恶性乳腺癌中的一小群乳腺肿瘤干细胞(BTSC)具有自我更新功能并呈现显著的放射抵抗性,是放射抵抗性的根源。CD44+作为乳腺肿瘤干细胞的一个重要标志物,在不同恶性级别的乳腺癌中比例不同,已有研究证实CD44+细胞是放疗抵抗的根源之一[2-3]。此外,还可以使用肿瘤球形成能力以及侧群细胞的比率来衡量BTSC的活性[4-7]

TPX2是近年来研究比较热的一个基因,研究发现其在多种恶性肿瘤,如食管癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、人脑胶质瘤、唾液腺癌及卵巢癌中均有高表达,并且其高表达与肿瘤的生物学行为密切相关,阻断其表达可抑制肿瘤细胞的生长[8-10]。TPX2的下调在许多肿瘤细胞系中均导致细胞凋亡性死亡[11],但是TPX2在乳腺癌的表达情况、其与BTSC及乳腺癌细胞的放疗敏感性关系,尚未充分明确。

1 材料和方法 1.1 细胞培养

乳腺癌细胞株及永生化乳腺上皮细胞MCF-10A购买至上海中科院。所有细胞使用DMEM培养基(含10%胎牛血清),放置于含5%CO2的37 ℃的培养箱中培养。

1.2 实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法试验

提取细胞RNA使用TRIzol试剂法(Invitrogen)。实时荧光定量PCR的试剂盒(qSYBR-green-containing PCR kit)购自上海吉凯。

提取细胞蛋白质后,使用蛋白质印迹法检测相关蛋白在细胞中的表达水平。TPX2以及GAPDH抗体购自santa cruz。二抗购自中杉金桥。ECL显色发光试剂盒购自康维世纪。

1.3 细胞凋亡试验

检测细胞凋亡试剂盒(FITC-PI双染色)购自凯基公司。细胞染色后,使用流式细胞仪检测相关凋亡情况。

1.4 构建低表达TPX2基因的乳腺癌细胞

根据TPX2基因(NM-1003620)序列,设计合成已证实能稳定沉默TPX2基因的片段(shTPX2)。使用PCR技术,将shTPX2基因片段构建到慢病毒载体(pLK0.1)中。包装慢病毒,使用慢病毒上清感染MCF7细胞。根据绿色荧光蛋白筛选出稳定感染的细胞。

1.5 裸鼠皮下成瘤实验

将裸鼠随机分成4组,每组5只。将1×106个细胞接种于裸鼠皮下,接种后5 d,按以下方式处理:第1组为空白对照组,第2组为单纯放疗组,第3组为sh-TPX2组,第4组为放疗+sh-TPX2组。肿瘤体积每3 d监测1次。肿瘤体积使用V=π/6(高度×长度×宽度)公式计算。

1.6 统计学处理

使用SPSS 13.0软件进行统计学分析。两组之间的差异使用两独立样本t检验。多组之间的差异使用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 TPX2在乳腺癌细胞和组织中表达上调

本研究使用蛋白质印迹法试验检测TPX2在一系列乳腺癌细胞以及永生化乳腺上皮细胞MCF-10A表达的差异。结果提示,乳腺癌细胞株中TPX2的表达水平显著高于非癌细胞MCF-10A(图1P<0.05)。实时荧光定量PCR试验结果提示:与癌旁组织相比,乳腺癌组织中TPX2显著升高。

图 1 TPX2在乳腺癌细胞和组织中表达
2.2 敲除TPX2可以抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡

由于TPX2可能作为乳腺癌的一个促癌基因,本研究验证敲除TPX2之后,乳腺癌MCF-7细胞的相关功能变化。首先使用慢病毒感染MCF-7细胞,建立低表达TPX2蛋白的细胞株(图2A)。平板克隆试验发现:敲除TPX2蛋白后,MCF-7细胞形成克隆的数目和大小较空白对照组明显减弱(图2BP<0.05)。MTT试验发现敲除TPX2蛋白后,细胞生长的速度明显减慢(图2C)。凋亡试验发现敲除TPX2蛋白后,可以促进MCF-7细胞的凋亡(图2D)。

图 2 敲除TPX2抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡
2.3 敲除TPX2可以减低乳腺癌干细胞活性及提高放疗敏感性

进一步研究TPX2基因是否可以影响乳腺癌干细胞活性及放疗敏感性,发现敲除TPX2基因之后,MCF7细胞中CD44+细胞的比例明显下降(图3A)。同时,MCF7细胞中侧群细胞的比例(图3B),以及形成肿瘤球的能力(图3C)也是显著下降的。

研究TPX2基因是否可以影响乳腺癌细胞的放疗敏感性,结果发现敲除了TPX2基因之后,MCF7细胞对放疗的敏感性升高(图3D)。

图 3 敲除TPX2减低乳腺癌干细胞活性及提高放疗敏感性
2.4 体内试验

使用裸鼠皮下成瘤试验,验证敲除了TPX2基因之后,乳腺癌细胞生长能力及对放疗敏感性的变化情况。结果发现:TPX2基因敲除后,MCF7细胞皮下成瘤的能力下降。与对照相及单纯放疗组相比,敲除了TPX2基因之后可使放疗的敏感性增加(图4)。

图 4 敲除TPX2基因增加放疗敏感性
3 讨论

肿瘤干细胞能促使肿瘤细胞逃脱机体免疫系统的监控,从而导致肿瘤形成和无限生长。肿瘤干细胞能够耐受传统的细胞毒化疗和放射治疗,是肿瘤复发、转移及治疗耐受的根本原因。肿瘤干细胞和放疗抵抗密切相关:肿瘤干细胞对放疗产生抵抗的原因可以归结为以下几点:①放射通过引起DNA双链断裂和DNA-蛋白交联,最终导致细胞死亡。因此DNA的修复能力是影响细胞存活或者死亡的重要因素。肿瘤干细胞比普通肿瘤细胞具有更强的DNA修复能力,所以在相同的放疗剂量下,能够更好地存活[12]。②细胞周期可影响细胞对放疗的敏感性。一般而言,处于有丝分裂期(M期)的细胞对放疗相对敏感。肿瘤干细胞较长时间处于G0静滞期,相对处于休眠状态,细胞周期的推进较为缓慢,这导致了CSC对放疗的敏感性大大降低[13]

乳腺癌细胞中存在一定比例的BTSC,这类细胞具有肿瘤干细胞活性。BTSC可能是乳腺癌细胞产生放疗抗性的根本原因,阻断BTSC的活性能够使乳腺癌患者对治疗更好的获益。目前,可以使用CD44表明抗原标记物,肿瘤球形成能力以及侧群细胞的比率来衡量BTSC的活性[14]。TPX2基因在很多实体瘤里面被普遍认为是一个促癌基因,比如:TPX2蛋白高表达和晚期透明细胞肾癌具有正相关性,是该类肾癌患者根治术后的预后预测指标之一[15]。TPX2蛋白高表达还可以通过活化AKT信号通路,从而促进胶质瘤细胞的生长和侵袭水平[16]。在胃癌中,TPX2蛋白可作为患者预后的指标,其水平升高预示患者预后不佳[17]。TPX2还可以促进肝癌细胞的增殖,抑制凋亡,并通过上皮-间充质转化导致肝癌细胞的侵袭[18]。但TPX2在乳腺癌中的表达情况及作用尚未充分明确。本研究发现,TPX2基因在乳腺癌组织及细胞中的表达水平都是升高的,其可能作为一个促癌基因。进一步的细胞功能发现,TPX2基因可以促进乳腺癌细胞的生长能力。而敲除TPX2基因之后,可以促进细胞的凋亡。本研究结果充分表明TPX2可以通过促进生长,抑制凋亡,从而导致肿瘤的发生和进展。有意思的是,敲除TPX2基因之后,还可以使乳腺癌干细胞的活性下调,从而使乳腺癌细胞的放疗敏感性增加。裸鼠体内试验结果与体外试验一致,充分肯定了TPX2基因可增加BTSC活性,及导致乳腺癌细胞产生放疗抗性。

基于TPX2在乳腺癌中的重要作用,本研究认为:靶向TPX2基因的治疗,有可能为克服临床上乳腺癌细胞的放疗抗性提供新的治疗思路。

参考文献
[1] Wu SG, He ZY, Zhou J, et al. Serum levels of CEA and CA15-3 in different molecular subtypes and prognostic value in Chinese breast cancer[J]. Breast, 2014, 23(1): 88–93. DOI:10.1016/j.breast.2013.11.003
[2] Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, et al. Schmitt F and paredes J. breast Cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression distribution within intrinsic molecular subtype[J]. J Clin Pathol, 2011, 64(11): 937–46. DOI:10.1136/jcp.2011.090456
[3] Weng D, Song B, Koido S. Immunotherapy of radioresistant mammary tumors with early metastasis using molecular chaperone vaccines combined with ionizing radiation[J]. J Immun, 2013, 191(2): 755–63. DOI:10.4049/jimmunol.1203286
[4] Britton KM, Kirby JA. Cancer stem cells and side population cells in breast cancer and metastasis[J]. Cancers, 2011, 3(2): 2106–30.
[5] Hiraga T, Ito S, Nakamura H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential[J]. Oncology reports, 2011, 25(1): 289–96.
[6] Cao L, Zhou Y, Zhai B, et al. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines[J]. BMC Gastroent, 2011, 23(11): 71–6.
[7] Lombardo Y, de Giorgio A, Coombes CR. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines[J]. J Vis Exp, 2015, 9(7): 12–8.
[8] Wei P, Zhang N, Xu Y, et al. TPX2 is a novel prognostic marker for the growth and metastasis of colon cancer[J]. J Transl Med, 2013, 11(6): 31–3.
[9] Neumayer G, Helfricht A, Shim SY, et al. Targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2 (TPX2) regulates gamma-Histone 2AX (gamma-H2AX) levels upon ionizing radiation[J]. J Biol Chem, 2012, 287(50): 42206–22. DOI:10.1074/jbc.M112.385674
[10] Neumayer G, Belzil C, Gruss OJ, et al. TPX2: of spindle assembly, DNA damage response, cancer cellular and molecular life sciences[J]. CMLS, 2014, 71(16): 3027–47. DOI:10.1007/s00018-014-1582-7
[11] Yang Y, Li DP, Shen N, et al. TPX2 promotes migration and invasion of human breast cancer cells[J]. Asian Pacif J Trop Med, 2015, 8(12): 1064–70. DOI:10.1016/j.apjtm.2015.11.007
[12] Bao S, Wu Q, Mclendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J]. Nature, 2006, 444(20): 756–60.
[13] Shima H. Acquisition of G(0) state by CD34-positive cord blood cells after bone marrow transplantation[J]. Exp Hematol, 2010, 38(12): 1231–40. DOI:10.1016/j.exphem.2010.08.004
[14] Xun J, Wang DK, Shen L, et al. JMJD3 suppresses stem cell-like characteristics in breast cancer cells by downregulation of Oct4 independently of its demethylase activity[J]. Oncotarget, 2017, 8(13): 21918–29.
[15] Glaser ZA, Love HD, Guo S, et al. TPX2 as a prognostic indicator and potential therapeutic target in clear cell renal cell carcinoma[J]. Urol Oncol, 2017, 13(5): 286–93.
[16] Gu JJ, Zhang JH, Chen HJ, et al. TPX2 promotes glioma cell proliferation and invasion via activation of the AKT signaling pathway[J]. Oncol Lett, 2016, 12(6, B): 5015–22.
[17] Liang B, Zheng WJ, Fang L, et al. Overexpressed targeting protein for Xklp2 (TPX2) serves as a promising prognostic marker and therapeutic target for gastric cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2016, 17(8): 824–32. DOI:10.1080/15384047.2016.1195046
[18] Liang B, Jia CH, Huang Y, et al. TPX2 level correlates with hepatocellular carcinoma cell proliferation, apoptosis and EMT[J]. Dig Dis Sci, 2015, 60(8): 2360–72. DOI:10.1007/s10620-015-3730-9