1987年第一台商业化的激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM)出现，随之共聚焦显微镜技术成为了一个热点，并广泛应用在国内外生物和工业检测领域。现今，我们将LSCM首次应用于国内古气候纹层学研究。纹层学一直是古气候研究重要内容^[1]，特别是荧光微层在很多古气候载体中是重要的年代标尺和气候指标^[2~13]。2000年，Ribes等^[14]首次将LSCM应用于石笋荧光微层研究，发现LSCM分辨率可达1μm，因此，可适用于各种不同厚度的石笋年纹层；2008年，Orland等^[15]将LSCM与离子探针采样结合，首次发现了石笋δ¹⁸O的季节性信号，并表示以色列Soreq Cave单层δ¹⁸O季节波动可达2.15 ‰；2010年，Dasgupta等^[16]通过LSCM识别石笋纹层中的碎屑和粘土层，据此重建了美国明尼苏达州过去3000年极端暴雨事件，发现20世纪全球升温以来，其暴雨频率明显增加；2015年，Wendt^[17]利用LSCM，在巴西TBV Cave石笋纹层中发现了罕见的“双纹层”，且均出现在高生长速率的Heinrich事件期间，认为这与Heinrich期间，Intertropical Convergence Zone(ITCZ)南支南移所导致一年内存在2个雨季有关；2015年，Orland等^[18]再次将LSCM与离子探针技术应用于中国苦栗树洞石笋研究，发现全新世和Bølling-Allerød暖期的夏季降水比例明显多于Younger Dryas时期。而目前，国内主要依赖于普通透射光和荧光显微镜，这一定程度上限制了国内古气候学研究。笔者在西安交通大学机械制造系统工程生物制造中心，利用购置的LSCM组件(图 1a)，观察石笋“年纹层”和砗磲“天纹层”，取得初步认识，以下分别就LSCM及其在古气候荧光微层方面的应用及注意事项作一简介。

图 1(Fig. 1)

图 1 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)组件(a)及其原理(b) 1.倒置荧光显微镜(Inverted fluorescence microscope)；2.荧光探测器(Fluorescence detector)；3.激光发生器(Laser generator)；4. LSCM总控制器(Main controller)；5.扫描头(Head of laser scanner)；6.明场及电动载物台开关(Switch of bright-field microscopy and electric stage)；7.荧光光源开关(Switch of fluorescent source)；8.电动载物台(Electric stage)；9. LSCM连接电脑(Computer and Monitor) Fig. 1 Laser scanning confocal microscope(LSCM) components (a) and operation principle (b)

LSCM以激光为点光源，由照明针孔与探测针孔对被探测点的共轭关系(图 1b)，实现对被探测点所在焦面的逐点激发，逐点扫描，该技术称为共聚焦。与普通荧光显微镜一次性照明整个视野不同，LSCM通过逐点扫描探测，呈现标本荧光层的2维或3维图像(图 2)，因此其对不同焦点和焦面的辨析能力，是普通荧光显微镜所不能达到的。其中，图 2a中3D切片z轴步进间距(即焦面间距)为3μm，当前仪器上限25nm(仪器型号：Nikon A1)。在LSCM标本纹层成像过程中，放置于探测器前的探测针孔(Pinhole)(图 1b)起着关键作用，有效地阻挡了不同焦点带来的杂散光，只有被探测点所发射的荧光透过Pinhole，到达探测器形成图像，这对图像对比度和分辨率有重要影响(图 2)。而且LSCM采用光电倍增技术，可将微弱荧光信号进一步放大。综上，利用LSCM可以真正地实现10μm级荧光纹层的清晰辨别，其分辨率和辨识度是普通荧光显微镜所不能实现的，在此基础我们可以观察并辨别10μm左右石笋“年纹层”(图 2d)和3~5μm级别砗磲“天纹层”(图 2e)。

图 2(Fig. 2)

图 2 石笋荧光层3D切片拟合(a)、石笋荧光“年纹层”(b、c和d)和砗磲荧光“天纹层” (e) 所有图像在1024扫描分辨率下，利用波长为488-nm的蓝色激光作为激发光源激发，然后用荧光滤光片滤选发射波长为505~539nm绿色发射光，最终被检测器探测并扫描成像；图片(a)由LSCM连续拍摄31层平行荧光焦面拟合而成，3μm/层；石笋样品(a)和(c)取自湖北省犀牛洞，(b)取自南京葫芦洞，(d)取自吉林省琉璃洞；(e)砗磲取自中国南沙群岛永暑礁 Fig. 2 3-D stack of slices of speleothem fluorescence laminae (a), annual fluorescence laminae of speleothems(b, c and d) and daily fluorescence laminae of Tridacnidae (e). All images were obtained by confocal microscope using 488-nm laser(blue)as excitation light source under 1024 scanning resolution. An emission filter was used to select green light with wavelengths between 505nm and 539nm. 3D image (a) is based on slices of 31 fluorescence focus surface at 3μm/layer. (a)and (c) are speleothem samples from Xiniu Cave, Hubei; (b)Speleothem sample from Hulu Cave, Nanjing; (d)Speleothem sample from Liuli Cave, Jilin; and (e)Tridacna gigas specimen from Yongshu Island, Nansha Archipelago

不同于普通光学显微镜，通过制作极薄的显微镜薄片(≤1mm)实现对于杂散光或荧光焦面的控制。LSCM装配倒置荧光显微镜直接对古气候标本切面观察，源于LSCM对不同焦面荧光信号的精准解析和辨别能力，对于石笋和砗磲等古气候标本，无需制作显微镜薄片，只需将样品切面抛光磨平，即可实现对抛光表面荧光微层和透光微层定焦高分辨率扫描。LSCM极大地简化标本处理，不仅能够更好地节约和保护标本，且能和其他分析(如稳定同位素分析)在同一样品上进行，有利于精细对照，对于古气候研究有重要意义。例如，最近Li等^[19]在其他方法精确定年困难的情况下，利用LSCM方法精确确定了近百年石花洞的石笋样品年代序列；对著名的南京葫芦洞样品的初步工作显示，将能够重建上个冰期精细到年的时间序列及气候变化的变率(图 2b)，而又不破坏极其珍贵的样品。

但是由于LSCM以激光作为光源，在镜下观察过程中发现，根据物镜倍数(10×、20×、40×、60×和100×)不同，导致激光聚光强度不同，会出现不同程度的荧光猝灭，对于常用倍数10×和20×，荧光猝灭微弱，肉眼无法识别，可忽略。但是在60×油镜及以上倍数，荧光猝灭快速，因此在使用过程中，要注意调焦与拍摄时间的平衡。另外，计算机对焦过程是纳米级对焦，在标本前期处理过程中，保证样品观察面平整，是快捷对焦、自动扫描和拼接大图的工作基础。对于目前使用的型号Nikon A1，由于LSCM电动载物台承重和规格限制，以及明场聚光器位置限制(图 1a)，要求古气候标本观察面≤ 6cm×6cm，厚度≤ 5cm，但可根据需要选择不同型号的载物台。最后，由于各种LSCM在许多研究机构和医学院都具备，且使用费用不高，因此进行该研究不必购置新设备。

近年来LSCM推出了双光子技术^[20]，即利用两个低能量激发光子激发一个荧光分子，其荧光波长等于一个高能量单光子直接激发一个荧光分子，却降低荧光损耗，并具有更高的激发功率和稳定的穿透力，从而提高图片分辨率，值得进行尝试和应用。总之，LSCM技术因其简单易行的前期处理、高辨识度的后期成像及无损于样品等优势，将对古气候纹层学和精细年代学研究起到极为重要的促进作用。

致谢 感谢中国科学院地质与地球物理研究所谭明老师提供石笋微层学的系统教学与耐心指导。感谢中国科学院地球环境研究所黄土与第四纪地质国家重点实验室晏宏研究员和马小林博士后提供宝贵的砗磲样品照片和支持，以及谭亮成老师给予东北野外采样鼎力支持。感谢审稿专家和编辑部杨美芳老师提出宝贵的修改意见。感谢西安交通大学机械制造系统工程生物制造中心曲晓丽老师和蔚萍萍老师给予的技术指导。