甘油二烷基甘油四醚微生物类脂物(glycerol dialkyl glycerol tetraethers,简称GDGTs,如图1)因其在自然环境中分布广泛,结构稳定,组成多样等特点,备受诸多学者青睐。近年来,GDGTs已被广泛应用于古气候古环境研究领域中。例如,Schouten等[1]利用源于海洋浮游型奇古菌细胞膜的类异戊二烯GDGTs(isoprenoid GDGTs,简称iGDGTs),建立了指示过去海水表面温度(SST)变化-TEX86指标; Weijers等[2]利用土壤中细菌支链GDGTs(branched GDGTs,简称bGDGTs)建立的甲基化指数(methylation of branched tetraethers,简称MBT)和环化指数(cyclization of branched tetraethers,简称CBT),提出了年平均大气温度(MAT)和土壤pH计算指标,并重建了过去2.5万年来非洲大陆地区的气候[3]。类似的例子很多,但截至当前,上述这些指标除在海洋沉积物中的大量研究外,随着研究的深入,在陆相载体中如土壤[2, 4, 5]、 湖泊[6, 7, 8]、 泥炭[9, 10]、 石笋[11, 12]等的研究也毫不逊色。
然而,相比之下,中纬度高海拔低温湿地生态系统微生物类脂物的研究相对薄弱[13]。为此,本研究选取青藏高原东部泥炭作为研究对象,分析现代泥炭中的GDGTs分布特征以及其记录的微生物群落对微环境的响应,并且进一步探讨并评价细菌bGDGTs建立的气候指标在研究区的适用性。
红原泥炭区(图2)位于青藏高原东部边缘,四川省西北部,地处中国最大的草原泥炭沼泽。该区属高原寒温带湿润季风气候,春秋时间短、 长冬无夏,区内年平均气温0.6-1.2℃,年平均降雨量为560-860mm,昼夜温差大,雨量充足,雨热同期。
越西泥炭区(图2)位于四川省越西县保安藏族乡,属山间湖沼盆地。盆周山坡陡峻,盆地平缓,该区属亚热带湿润季风气候,冬寒夏凉,年平均温度是13.3℃。
利用泥炭钻在红原地区(采样坐标为32°46′N,102°31′E,海拔高度约3508m)采集长约50cm的泥炭短柱,同时在附近用小铁铲采集了15个现代表层样品(采样深度约为5cm); 越西地区(采样坐标为28°46′N,102°34′E; 海拔高度约1981m)用小铁铲共采集约5个现代表层样品(采样深度约为5cm)。每一表层样品以间隔约200m进行采集,采集后用锡箔纸包裹,标上样号,放入携带的装有液氮的液氮罐中冷藏。其中红原50cm泥炭柱在1-3cm为深褐色,含较多未分解或部分分解的植物残体; 4-10cm为褐色,植物残体完全分解; 11-50cm为深褐色,植物残体部分分解。柱状泥炭样品在野外以1cm分割,并用锡箔纸包裹,标上样号,放入携带的装有液氮的液氮罐中冷藏。样品运回实验室后,在-10℃条件下保存以备进一步分析。
1.2 GDGTs的前处理和仪器分析样品先冷冻干燥,然后用玛瑙研钵磨碎到80目左右,之后称取约0.5g样品,放入聚四氟乙烯的离心管中,用二氯甲烷与甲醇混合溶液(溶液体积比为9︰1,v︰v)对样品进行超声抽提8次,得到的总抽提物在旋转蒸发仪(40℃水浴)上浓缩至1-2ml。浓缩的样品转移到细胞瓶后在加热板上烘干。柱层析用正己烷与甲醇和二氯甲烷的混合试剂(溶液体积比为1︰1,v︰v)分离出非极性组分和极性组分。样品分离后将极性组分浓缩至1-2ml,用0.45μm聚四氟乙烯滤膜(PTFE)过滤,并将其用氮气吹干。在干样中加入内标C46 GDGT,溶解于正己烷: 异丙醇(99︰1,v︰v)混合溶剂中,用液相色谱-质谱联用仪进行测试分析。仪器型号是Agilent 1200 HPLC,6460A三重四级杆质谱仪,配备有大气压化学电离源(APCI)与电喷雾(ESI)两种离子源。色谱柱为Alltech Prevail 氰基柱(150mm×2.1mm,3μm)。GDGTs化合物检测条件为[14]: 正己烷和异丙醇作为流动相,洗脱梯度为0-5分钟,99%正己烷(B):1%异丙醇(A); 5-45分钟,正己烷比例从99%线性减至98.2%,之后冲洗色谱柱并回到99%正己烷,流速保持0.2ml/分钟。为提高检测信噪比和重现性,采用单离子扫描模式(SIM)对离子进行扫描,扫描核质比(m/z)为1302、 1300、 1298、 1296、 1294、 1292、 1050、 1048、 1046、 1036、 1034、 1032、 1022、 1020、 1018和744。样品重复2次以检验数据在仪器上的重现性,测量误差均在±0.02之内。
2 结果与讨论 2.1 GDGTs的组成及分布特征泥炭样品均检测出了较为丰富的iGDGTs和bGDGTs(图3和4)。古菌膜类脂物iGDGTs主要以无环的GDGT-0和archaeol为主,GDGT-1-GDGT-3含量较低,泉古菌醇(Crenarchaeol,简称Cren)和它的立体异构体Cren′的含量最低,部分样品甚至未检测出(图3)。此外,细菌膜类脂物bGDGTs在两研究区中均检测出,其中红原泥炭柱样中bGDGTs占所有GDGTs化合物总量的82.6%-95.2%; 红原和越西现代表层样品中的bGDGTs分别占GDGTs化合物总量的86.3%-97.7%和84.8%-89.8%。在所有样品bGDGTs中,Ia、 IIa含量最高,其次是Ⅲa、 Ib、 IIb,其他含量均很低,甚至未检测出(图4)。
研究表明,GDGT-0与crenarchaeol比例的增加可能代表古菌群落中产甲烷古菌类群的增加[15, 16],archaeol也是产甲烷菌的标志物[17]。因此,GDGT-0和archaeol被认为是产甲烷菌的生物标志物[13, 17]。泉古菌醇主要源于氨氧化古菌[18],bGDGTs目前认为主要源于厌氧细菌[19],且大多是嗜酸性厌氧细菌[20]。因此不难看出,青藏高原东部泥炭中存在产甲烷菌、 氨氧化古菌、 厌氧嗜酸菌等多种微生物。
在红原泥炭柱样中,整体上,古菌与细菌膜类脂物iGDGTs与bGDGTs比值随深度的增加有上升趋势,且期间有多次波动(图5)。主要表现为: 在49-25cm之间比值相对稳定,大多在0.15左右变化; 在上部的1-25cm,比值相对较低(<0.15),且波动幅度较大。整个剖面中,不难发现,源于bGDGTs的厌氧酸性细菌明显较古菌微生物丰富。上部较低的iGDGTs与bGDGTs比值与红原泥炭地表层样品中的比值(0.02-0.16)较为接近。泥炭上层一般为水体动荡的氧化环境,随深度增加,还原环境显著且稳定,这似乎表明古菌相对于厌氧的酸性细菌而言,更适应于泥炭下部的还原环境。iGDGTs与bGDGTs比值随深度多次的变化说明,泥炭水位的多次波动导致沼泽微环境的变化,从而可能引起产甲烷菌与厌氧酸性菌的相对输入不同。
泥炭地作为陆地生态系统的组成部分,是重要的碳资源储存库,其碳储量约占全球土壤碳库的1/3[21]。泥炭地甲烷的主要生产者是产甲烷菌[22, 23],它作为一类厌氧古菌,能将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳。因此,产甲烷菌在泥炭微生物中的相对含量的多少对泥炭地释放甲烷以及全球气候变化等研究有着重要的意义。
由图3和图5可以看出,所有泥炭样品含有较丰富的GDGT-0和archaeol。在红原泥炭柱中,二者(GDGT-0与archaeol之和)共占iGDGTs化合物总量的79.3%-96.7%; 现代表层样品中,二者在红原地区共占67.3%-97.8%,在越西地区共占70.1%-83.8%。这说明产甲烷菌在泥炭环境中含量丰富,并且是古菌的主要类群。
虽然在泥炭中GDGT-0与archaeol主要源于产甲烷菌,但二者随深度的变化趋势具有显著差异。整体上,GDGT-0与GDGTs比值随着深度的增加而增加; archaeol与GDGTs比值从底部向上呈现出低—高—低的变化趋势(图5)。特别值得注意的是,archaeol与GDGT-0比值随着深度增加有降低的趋势(图5)。产甲烷菌主要生活在厌氧环境中,故在泥炭表层中产甲烷菌化合物的量较低。随着深度的增加,产甲烷菌化合物含量应该增加,但不同的微气候微环境的变化可能导致其间存在较多的波动。研究发现,在低温环境下,产甲烷菌产生的甲烷途径主要是H2/CO2营养型和乙酸营养型产甲烷途径[24, 25]。对泥炭沼泽湿地生态系统的研究表明,在表层泥炭中以乙酸型产甲烷途径为主,而在深层泥炭中,H2/CO2营养型产甲烷途径占优势[26]。目前普遍认为,乙酸是低温湿地中主要的产甲烷物质; 而氢来源的甲烷主要发生在温度较高的地区或酸性泥炭土中[27, 28]。Zhang等[29]运用分子生物学技术对红原泥炭产甲烷菌研究发现,乙酸型Methanosarcinales与 H2/CO2型Methanomicrobiales是研究区主要的产甲烷菌。红原泥炭为低温泥炭,archaeol与GDGT-0比值随着深度虽然有多次的波动,但整体是随着深度的增加而降低(图5),结合上述分子生物学结果,可能暗示二者源于不同的产甲烷菌类型。最近,Naeher等[30]通过研究Rotsee湖泊沉积物表明GDGT-0主要是乙酸型的产甲烷菌标志物,而archaeol很有可能是H2/CO2利用型的产甲烷菌标志物。结合前人的研究,我们推测archaeol和GDGT-0或指示不同的产甲烷菌,或对泥炭微环境的响应有差异,这需要今后进一步深入和验证。
2.4 土壤细菌膜类脂物bGDGTs指标的应用 2.4.1 pH值用Weijers等[3]与Peterse等[31]建立的MBT′-CBT指数校正公式(如下)对pH值及其他参数进行了计算:
由以上公式,计算出红原表层样品pH值为4.9-6.3,主要集中在5.5左右; 越西表层样品pH值为5.5-6.5,多集中于6左右(图6)。这些计算的pH值与当时野外实测的采样孔隙水的pH值(红原测量pH值约为5-6,越西测量pH值约为6)较为接近。
在红原泥炭柱中,其环化指数(CBT)为0.86-1.36,甲基化指数(MBT′)为0.28-0.42,pH值的变化范围为5.2-6.2(图7)。泥炭剖面pH随深度的变化趋势非常明显,曲线变化大致经历两个阶段: 第一个阶段,49-23cm深度pH值由5.9缓慢升至6.1,整体上变化幅度很小,泥炭呈弱酸性。第二阶段,23-1cm深度pH值先由6.1较快降至5.2,然后由5.2缓慢升至5.9,且pH值波动较为强烈。我们推测,这可能是由于在近代历史时期红原为无人或半无人的原始沼泽,pH相对稳定; 之后由于该区域大规模毁林开荒等人类活动造成大量腐殖质的沉积,使得pH下降; 近几十年,人类活动的干扰使得腐殖质减少,pH又逐渐上升[32]。
因此,由泥炭柱样计算的pH变化趋势与当地实际pH变化趋势基本吻合。同时,根据两研究区泥炭pH计算结果,说明通过现代土壤过程建立的环化指数CBT和pH的关系式可能适用于重建研究区泥炭pH值。
2.4.2 MAT在红原表层样品中,基于MBT′-CBT得到的年平均大气温度(MAT)[31]为1.8-9.2℃,多集中在4℃(图6),要明显高于红原气象站记录的45年平均气温(0.9℃)[33]。越西表层样品计算的MAT为8.7-12.0℃,多集中在10℃(图6),要低于当地年均大气温度(13.3℃)。
在红原泥炭剖面中,MAT随深度变化经历3个阶段(图7),49-23cm,气温从4.5℃缓慢升至6.3℃; 23-11cm,气温迅速下降,由6.3℃降至1.9℃; 11-1cm,气温再次升高,由1.9℃迅速升至8.1℃。整体上,剖面上部恢复的古温度值都快速增加,这与近百年来中国的增温趋势基本相同。
Zhou等[32]通过对Weijers等[2]研究的全球112个样品计算发现,高海拔低温地区且MAT<10℃的采样点计算的MAT较实测温度高; 在年均温较高(MAT>10℃)的地区计算的MAT要低于实际测量值,这与我们的研究一致。特别要注意的是,在同一采样点的现代表层泥炭样品具有相同的年均温度,而由校正公式计算出的MAT却存在一定的变化范围。造成这种差异的原因一方面可能是大气温度和微生物实际生长环境(泥炭、 土壤等)温度间存在一定的偏差[31],另一方面可能由于沼泽微环境、 采样深度等稍有不同所致。
但很显然,红原地区MAT明显高于研究区现代年均气温(0.9℃),这一现象也出现在以前的研究中。例如,Weijers等[34]通过研究全球8个采样点的土壤时,发现由MBT-CBT计算得出的温度(约 10.3±1.2℃)远高于实际测量的大气年均温度值(3.8℃),但接近于测量土壤的年均温度值(约8.2℃)。此外,Huguet等[9]在研究Frasne泥炭时,提出产bGDGTs的细菌可能在一年中最温暖的月份更为活跃,认为由MBT-CBT指标得到的温度反映当地温暖季节的平均温度。红原地区现代夏季均温在8.8-10.0℃之间变化[32],与MAT范围大致接近。因此,推测研究区由MBT′-CBT得到的MAT很可能反映的是该区季节温度,而非年平均大气温度。但是,相对于全球性的校正,如果能够进行区域地区的校正很可能给出更为准确地的温度变化。
3 结论通过研究青藏高原东部现代泥炭中GDGTs分布特征、 微生物群落对微环境的响应及评价细菌bGDGTs建立的气候指标在研究区的适用性,得出以下结论:
(1)青藏高原东部泥炭样品中bGDGTs丰度高于iGDGTs,其中Ia、 IIa在bGDGTs占优势,无环的GDGT-0和archaeol是古菌iGDGTs的主要组分。这些均表明研究区广泛分布着产甲烷菌、 氨氧化古菌、 厌氧嗜酸菌等多种微生物。其中产甲烷菌是古菌群落的主要类型。
(2)由CBT指标计算出的pH值与泥炭实测pH值相近,表明该指标可能适用于重建该泥炭地pH值,需要今后进一步验证。由MBT′-CBT指标计算的年平均大气温度(MAT)在红原地区高于研究区现代年平均温度,而在越西地区低于研究区现代年平均温度,该指标很可能反映低温泥炭的季节温度,而非大气年均温度。因此,相对于全球性的校正,区域的校正很可能给出更为准确的温度变化。
致谢 感谢中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室对实验工作的极大支持,感谢两位审稿人对论文提出的宝贵修改意见,感谢惠格格对论文相关图表修改的帮助。
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Abstract
In our study, the samples were collected from 2 modern peat sediments, namely Hongyuan region(32°46'N,102°31'E; 3508m a.s.l.) and Yuexi region(28°46'N,102°34'E; 1981m a.s.l.) in the eastern Tibetan Plateau.The glycerol dialkyl glycerol tetraethers(GDGTs) in all samples were analyzed by high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry(HPLC-APCI-MS).Our results have shown that microbial assemblages are abundant in the Tibetan peats, including methanogens, ammonia-oxidising Thaumarchaeota and likely anaerobic bacteria based on distributions of branched and isoprenoidal GDGTs.Branched GDGTs(bGDGTs) are much more abundant than the isoprenoid GDGTs(iGDGTs).GDGT-0 and archaeol are predominant in all peat samples, indicating that methanogens are the major archaea.The branched GDGTs are dominated by bGDGT Ia and Ⅱa.The cyclization of bGDGTs(CBT)-derived pH values are closed to the measured peat pH in the study regions.However, the mean annual air temperature(MAT) estimates derived from the methylation of bGDGTs and cyclization of bGDGTs(MBT'-CBT) are different from the present mean annual temperature of the study regions.MBT'-CBT-derived MAT values are higher than present mean annual temperature in Hongyuan region and lower than that in Yuexi region.Taken together, the global soil calibration of(Peterse et al., 2012) [