2020, Vol. 48
文章信息
- 张孜文, 张康民, 杨建军, 吴庆云, 吴明元, 张建安, 刘久逸
- ZHANG Zi-wen, ZHANG Kang-min, YANG Jian-jun, WU Qing-yun, WU Ming-yuan, ZHANG Jian-an, LIU Jiu-yi
- 聚六亚甲基胍盐酸盐功能化中空纳米二氧化硅制备新型抗菌剂的研究
- Novel antibacterial agent prepared by poly (hexamethylene guanidine hydrochloride) functionalized hollow nano-silica
- 材料工程, 2020, 48(3): 40-46
- Journal of Materials Engineering, 2020, 48(3): 40-46.
- http://dx.doi.org/10.11868/j.issn.1001-4381.2019.000015
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-09
- 修订日期: 2019-08-22
感染控制在各个领域都具有极其重要的意义。因此，能够有效抑制微生物生长且细胞毒性低的抗菌材料引起了广泛的研究兴趣。抗菌药物，例如三氯生、季铵盐、壳聚糖、N-卤胺、金属离子、活性氧和聚胍等[1-7]，在生物医学、食品包装和卫生等领域的灭菌得到广泛应用。其中胍盐聚合物由胍盐和二元胺熔融缩聚而成，如聚六亚甲基胍盐酸盐(PHMG)，它们具有高效广谱的抗菌活性，且对于哺乳动物细胞毒性很低[3, 8-9]。然而，由于胍盐聚合物良好的水溶性，很难将其回收，结果会导致二次污染；而如果将这种水溶性好的胍盐聚合物抗菌剂用作工业产品的添加剂，则最终产品的抗菌长效性不足。因此，开发具有优异抗菌性能和长效抗菌的胍盐聚合物复合材料是迫切需要的。
中空纳米二氧化硅(HSN)作为一种新的功能材料，比表面积大、低密度、稳定性高、无毒无害、无污染，且原料来源广泛，被广泛应用于填充、催化、光电、涂料和载药等领域[10-12]，同时也是一种良好的抗菌剂载体[13-17]。近年来本课题组在简易大量合成HSN方面做了很多工作，发现采用细乳液法可以一步制得具有良好中空结构的HSN，且该方法操作简单、成本低、产率高、易于改性、可大量合成，具有很高的性价比。目前关于PHMG与二氧化硅复合材料的研究主要集中在介孔二氧化硅与PHMG通过离子键作用结合并用于水处理中金属离子的吸附[18-19]，而关于PHMG通过环氧基键合在中空二氧化硅表面并用于抗菌的研究鲜有报道。
本研究通过盐酸胍与己二胺的熔融缩聚制得PHMG[9]，然后采用细乳法一步合成γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)改性的HSN即表面环氧基化的中空纳米二氧化硅(Epoxy-HSN)，利用氨基与环氧基的开环反应将PHMG接枝到HSN表面，制得抗菌剂HSN-PHMG。以革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coil)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为测试菌种，通过最小抑菌浓度实验与生物杀灭动力学实验定性地评价HSN-PHMG复合材料的抗菌活性。
1 实验材料与方法 1.1 实验原料盐酸胍(GHC, AR)，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560，98%)，甲基硅油(AR)，以上试剂购自上海麦克林生化有限公司；己二胺(HMDA，AR)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，AR)，以上试剂购自上海阿拉丁工业公司；盐酸(35%)，正硅酸四乙酯(TEOS，AR)，三乙醇胺(TEOA，AR)，以上试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司；Mueller-Hinton肉汤(AR)购自广东环凯微生物科技有限公司；大肠杆菌(E.coil，ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC29213)购自中国科学院微生物研究所。
1.2 合成 1.2.1 PHMG的制备采用两步聚合的方法制备PHMG[9]，取0.11 mol的HMDA和0.1 mol的GHC加入三口烧瓶中，混合物在搅拌条件下120 ℃反应2 h，然后升温至160 ℃反应5 h，反应过程中释放的氨气用0.1 mol/L的盐酸水溶液吸收，反应结束后，微黄色的黏性液体在冷却后凝固，然后在80 ℃的真空烘箱中放置1 d，除去残留氨气。
1.2.2 Epoxy-HSN的制备采用细乳液法合成KH560改性HSN，将0.3 g的CTAB加入100 g去离子水中搅拌均匀作为水相，将13.112 g的TEOS，1.31 g的KH560，1.458 g甲基硅油混合超声10 min作为油相，在搅拌条件下将油相缓慢加入水相中，继续搅拌20 min后冰水浴下使用均质乳化机均质乳化5 min，加入0.348 g的TEOA，室温下机械搅拌24 h后得到KH560改性的HSN即表面环氧基化的中空二氧化硅(Epoxy-HSN)，用去离子水离心洗涤4遍后烘干备用。
通过Na2S2O3滴定法测定Epoxy-HSN中环氧基的含量。Na2S2O3与环氧基反应后生成的OH—用标准HCl滴定，结果表明Epoxy-HSN中环氧基的含量为135 μmol/g。
1.2.3 HSN-PHMG的制备称取0.2 g的Epoxy-HSN超声分散于80 mL去离子水中，称取0.5 g的PHMG溶于20 mL的去离子水中，将PHMG的水溶液加入Epoxy-HSN分散液中，室温下磁力搅拌24 h，得到HSN-PHMG，用去离子水离心洗涤5遍(除去过量的PHMG)后烘干备用。
1.3 HSN-PHMG的表征利用REGULUS8230超高分辨扫描电子显微镜(SEM)和JEM-2100高分辨透射电子显微镜(TEM)观察样品形貌；VERTEX80傅里叶红外变换光谱仪(FTIR)表征样品结构，分辨率为4 cm-1，测试范围为4000~500 cm-1；ESCALAB 250Xi X射线光电子能谱仪(XPS)对样品进行元素分析；PerkinElmer热重分析仪(TGA)，在N2气氛，升温速率10 ℃/min，50~800 ℃范围内对样品进行热重分析。
1.4 抗菌测试 1.4.1 MIC测试采用营养肉汤稀释法测定HSN-PHMG的最小抑菌浓度(MIC)，向含有不同HSN-PHMG浓度的液体培养基中接种测试菌种，在摇床中(240 r/min，37 ℃)培养24 h，肉眼观察是否有细菌生长，以空白液体培养基作为对照。测试菌种为革兰氏阴性菌：大肠杆菌(E.coil，ATCC25922)；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC29213)。
1.4.2 生物杀灭动力学实验将细菌在Mueller-Hinton肉汤中过夜培养，然后再用新鲜Mueller-Hinton肉汤稀释100倍，37 ℃培养至OD600=0.3。以不同浓度HSN-PHMG(64，128 mg/L)在37 ℃和250 r/min条件下对细菌进行处理。每隔一段时间进行菌落计数。测试菌种为革兰氏阴性菌代表：大肠杆菌(E.coil，ATCC25922)。
2 结果与讨论 2.1 HSN-PHMG的制备与表征 2.1.1 Epoxy-HSN与HSN-PHMG水分散性分析通过HMDA与GHC熔融缩聚合成PHMG，细乳液法合成Epoxy-HSN，在水体系中进行环氧基的室温开环反应。图 1为HSN-PHMG的合成示意图。如图 1所示，PHMG中的氨基与Epoxy-HSN表面的环氧基反应生成羟基并通过C—N键接枝到HSN表面。图 2为Epoxy-HSN与HSN-PHMG的水分散性对比图。由图 2可知，HSN-PHMG的水分散性明显优于Epoxy-HSN，经超声分散的Epoxy-HSN与HSN-PHMG水分散液静置4 d后，Epoxy-HSN水分散液全部沉降，而HSN-PHMG水分散液只有部分沉降；将它们重新超声分散后静置12 h，Epoxy-HSN水分散液全部沉降，说明Epoxy-HSN粒子之间已经团聚在了一起，而HSN-PHMG水分散液基本无沉降，这说明PHMG成功接枝到了HSN表面，分散在水中后PHMG发生电离在HSN的表面生成大量阳离子，使得HSN粒子之间产生静电排斥力，从而避免了HSN的团聚沉降。
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图 1 HSN-PHMG的合成示意图 Fig. 1 Schematic illustration of the HSN-PHMG synthesis |
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图 2 超声分散后Epoxy-HSN (a)与HSN-PHMG (b)分散液静置4 d以及重新分散后静置12 h的图片(浓度为0.5 mg/mL) Fig. 2 Pictures of Epoxy-HSN (a) and HSN-PHMG (b) dispersion after ultrasonic dispersion for 4 d and after re-dispersion for 12 h (at the concentration of 0.5 mg/mL) |
图 3为Epoxy-HSN与HSN-PHMG的SEM和TEM图。从图 3(a-1)，(a-2)中可以看出Epoxy-HSN具有很好的中空结构，壳层厚度在15 nm左右，粒径在60 nm与400 nm之间，平均粒径在200 nm左右，且有少量的微球发生了破碎。将Epoxy-HSN水分散液与PHMG水溶液在室温下反应24 h后得到HSN-PHMG，从图 3可以看出HSN-PHMG的形貌与Epoxy-HSN的形貌基本一致，表明PHMG的接枝对HSN的形貌并没有影响。
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图 3 Epoxy-HSN (a)和HSN-PHMG(b)的SEM(1)和TEM(2)图 Fig. 3 SEM (1) and TEM (2) images of Epoxy-HSN (a) and HSN-PHMG (b) |
图 4为PHMG，HSN，Epoxy-HSN和HSN-PHMG的红外谱图。图 4中a曲线在3350(υNH), 3170(υNH)，1650(υC=N)cm-1和1630(δNH2) cm-1的出峰位置与其他学者提供的数据一致[9]，证明PHMG的成功合成；1080 cm-1处为二氧化硅结构中典型的Si—O—Si的伸缩振动峰[18]；图 4中c曲线在2926 cm-1与2850 cm-1处出现了亚甲基中C—H的伸缩振动峰，说明KH560与TEOS共水解生成了二氧化硅；如图 4中d曲线在1650 cm-1处出现了胍基中CN的伸缩振动峰，1354 cm-1处出现了C—N的伸缩振动峰，说明PHMG成功接枝到二氧化硅表面。
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图 4 PHMG，HSN，Epoxy-HSN和HSN-PHMG的红外谱图 Fig. 4 FTIR spectra of the PHMG, HSN, Epoxy-HSN and HSN-PHMG |
图 5为Epoxy-HSN和HSN-PHMG的全范围XPS光谱和C1s光谱。Epoxy-HSN的C1s谱(图 5(a-2))可以拟合出4条曲线，分别对应环氧基中的C—O—C(287.6 eV)、环氧基开环后的C—OH(286.2)[19]、C—H(284.8 eV)以及醚键中C—O—C(286.9 eV)；HSN-PHMG的全范围XPS光谱(图 5(b-1))中出现了N与Cl元素的峰，HSN-PHMG的C1s谱(图 5(b-2))可以拟合出5条曲线，288.85 eV为胍基中的C(N+)N、其余的分别对应醚键C—O—C(286.9 eV)、环氧基开环后的C—OH(286.2 eV)、C—N(286.0 eV)以及C—H(284.8 eV), 经PHMG接枝后环氧基消失，出现了C—N键，其中的C—N键包含PHMG中未反应完的C—NH2以及氨基与环氧开环反应生成的C—N键，这些都能证明PHMG的成功接枝。
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图 5 Epoxy-HSN (a)和HSN-PHMG (b)的全范围XPS光谱(1)和C1s光谱(2) Fig. 5 Full range XPS spectra (1) and C1s spectra (2) of Epoxy-HSN (a) and HSN-PHMG (b) |
通过TGA估算HSN-PHMG中PHMG的含量。图 6为Epoxy-HSN与HSN-PHMG的热失重曲线。在0~100 ℃的失重为样品中水分的蒸发；Epoxy-HSN中水与二氧化硅骨架质量分数分别为3.91%与72.6%；HSN-PHMG中水与二氧化硅骨架质量分数分别为3.79%与65.5%。按照下述公式计算HSN-PHMG中PHMG的质量分数：
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(1) |
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(2) |
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图 6 Epoxy-HSN与HSN-PHMG的热重曲线 Fig. 6 TG curves of Epoxy-HSN and HSN-PHMG |
式中：ω1和ω1′分别为Epoxy-HSN与HSN-PHMG中水的质量分数；ω2与ω2′分别为Epoxy-HSN与HSN-PHMG中二氧化硅骨架的质量分数；K为Epoxy-HSN中除去水与二氧化硅骨架以外的质量占二氧化硅骨架的质量分数；ωPHMG为HSN-PHMG中PHMG的质量分数；最终估算结果HSN-PHMG中PHMG的质量分数约为9.5%。
2.2 HSN-PHMG对细菌生长的抑制作用采用营养肉汤稀释法测定HSN-PHMG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC[20]。表 1为Epoxy-HSN，PHMG和HSN-PHMG对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC。由表 1可以看出，Epoxy-HSN对于测试细菌的生长影响很小，相关文献报道纳米二氧化硅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度一般为1~10 mg/mL[21]；相反PHMG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为4 mg/L，PHMG可以很好地抑制细菌生长；而两者的结合产物HSN-PHMG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为32 mg/L，相对于未接枝PHMG的HSN，接枝后的HSN抗菌性能得到了极大的提升。根据TGA数据分析结果：HSN-PHMG中PHMG的质量分数约为9.5%，表明PHMG与HSN之间存在着协同抗菌作用，在这里PHMG的接枝起着双重作用，一方面是PHMG本身的高效抗菌，另一方面是PHMG的接枝使得HSN的水分散性提高，而纳米二氧化硅在水中的有效分散影响着其抗菌性能[22]，即经过PHMG的接枝后HSN水分散液自身的抗菌性也会有所提高。
| Sample | MIC/(mg·L-1) | |
| E.coil | S.aureus | |
| Epoxy-HSN | ＞128 | ＞128 |
| PHMG | 4 | 4 |
| HSN-PHMG | 32 | 32 |
采用生物杀灭动力学实验进一步研究HSN-PHMG对于大肠杆菌的抗菌活性，其反映了HSN-PHMG对细菌的杀灭率。图 7为大肠杆菌的活力与在不同浓度HSN-PHMG下孵育的孵育时间的函数关系，图 8为大肠杆菌悬浮液接触不同浓度HSN-PHMG不同时间后的细菌菌落图。由图 7和图 8可看出，HSN-PHMG有着高效的杀菌能力：在浓度为MIC的2倍时，大肠杆菌在2 h内被全部杀死；如果浓度为MIC的4倍，则时间减少到1 h。PHMG通过破坏细菌膜快速杀灭细菌：胍盐聚合物利用胍基阳离子与带负电细菌之间的静电吸引附着于细菌表面后会抑制细菌生长，诱导细菌膜塌陷，细菌细胞内成分泄露，最终死亡[23]。当PHMG接枝到HSN上后便赋予了HSN这种高效抗菌的能力。
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图 7 不同浓度HSN-PHMG对大肠杆菌的抗菌动力学实验图 Fig. 7 Antibacterial kinetics of different concentrations of HSN-PHMG on E.coil |
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图 8 大肠杆菌悬浮液接触不同浓度HSN-PHMG不同时间的细菌菌落图 Fig. 8 Bacterial colonies of E.coil suspensions exposed to different concentrations of HSN-PHMG at different time |
(1) 通过细乳液法合成Epoxy-HSN，经PHMG的接枝后制得新型抗菌剂HSN-PHMG。SEM与TEM表征了Epoxy-HSN的中空结构，PHMG的接枝对其形貌基本无影响；FTIR与XPS表征了PHMG的成功接枝；根据TGA估算HSN-PHMG中PHMG的质量分数约为9.5%。
(2) HSN-PHMG表现出良好的水分散性和优异的抗菌性能；MIC实验结果表明HSN-PHMG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为32 mg/L，HSN-PHMG可以很好地抑制细菌的生长，且PHMG与HSN之间存在着协同抗菌作用；此外，时间杀灭曲线显示HSN-PHMG具有优异的杀菌能力，HSN-PHMG在浓度为64 mg/L时可以在2 h内完全杀死大肠杆菌。作为一种新型抗菌剂，HSN-PHMG具有抗菌活性强、制备成本低、制备简便等优点，在医疗保健、环境工程等领域有着广阔的应用前景。
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