材料工程  2018, Vol. 46 Issue (3): 34-40   PDF    
http://dx.doi.org/10.11868/j.issn.1001-4381.2017.001098
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秦晓素, 黄洁, 郭华超, 杨泽斌, 陈庆华, 颜廷亭
QIN Xiao-su, HUANG Jie, GUO Hua-chao, YANG Ze-bin, CHEN Qing-hua, YAN Ting-ting
骨组织工程用硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合多孔支架的制备与性能研究
Fabrication and Properties of Silica Gel/Calcium Sulfate/Strontium-doped β-tricalcium Phosphate Composite Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering
材料工程, 2018, 46(3): 34-40
Journal of Materials Engineering, 2018, 46(3): 34-40.
http://dx.doi.org/10.11868/j.issn.1001-4381.2017.001098

文章历史

收稿日期: 2017-08-31
修订日期: 2017-12-14
骨组织工程用硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合多孔支架的制备与性能研究
秦晓素 , 黄洁 , 郭华超 , 杨泽斌 , 陈庆华 , 颜廷亭     
昆明理工大学 材料科学与工程学院, 昆明 650500
摘要: 以掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙为原料,利用搅拌喷雾干燥法制备出掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合小球,再将硅胶与制备的复合小球复合,通过在模具中堆垛聚集的方法,制备出硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合生物支架。采用XRD,SEM,FT-IR等方法分析制得复合多孔支架的成分、形貌以及结构特征,并研究复合生物支架的降解性、孔隙率、力学性能和细胞毒性等。结果表明:该复合多孔生物支架具有一定的不规则孔洞结构,小球与小球之间的孔隙约为0.2~1mm,而每个小球上也有大量的微孔,孔径在50~200μm之间,且平均孔隙率达到62%,基本能满足骨组织工程支架对孔隙率的要求;该复合多孔支架无细胞毒性,其降解周期约为80天,抗压强度约为0.1MPa,因此该支架在非承重骨组织修复方面具有良好的应用前景。
关键词: 硅胶    掺锶β-磷酸三钙    硫酸钙    复合小球    多孔支架   
Fabrication and Properties of Silica Gel/Calcium Sulfate/Strontium-doped β-tricalcium Phosphate Composite Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering
QIN Xiao-su, HUANG Jie, GUO Hua-chao, YANG Ze-bin, CHEN Qing-hua, YAN Ting-ting    
Faculty of Material Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: The calcium sulfate/strontium-doped β-tricalcium phosphate composite spherical pellets was fabricated, using the calcium sulfate/strontium-doped β-TCP as raw material, and through the stirring spray drying method, and then composite spherical pellets were combined with silica gel, porous silica gel/calcium sulfate/strontium-doped β-tricalcium phosphate scaffold was obtained by stacking aggregation method in the mould. The XRD, SEM and FT-IR, etc are employed to examine the chemical composition, composite morphology and structure characteristics, and the degradability, porosity, mechanical properties and cytotoxicity of the scaffolds materials were studied. The results reveal that the composite porous scaffolds have irregular pore structure with pore size between 0.2-1.0mm, and they have a large number of micropores on each of the composite spherical pellets, with the aperture between 50-200μm. Moreover, the porosity of the composite scaffolds is about 62%, which can meet the requirements of scaffolds for bone tissue engineering in porosity; the cytotoxicity tests show the composite scaffolds have no cytotoxic effect and it has good degradation. Therefore, it has good application prospect in bone tissue engineering of the bone defect repair of non-bearing site.
Key words: silica gel    strontium-doped β-tricalcium phosphate    calcium sulfate    composite spherical pellet    porous scaffold   

近年来,由于各种疾病和事故造成骨组织缺损的病例越来越多[1],骨缺损的临床治疗一般采用自体骨移植、异体骨移植、组织替代物移植等方法[2]。但是自体骨移植容易对身体造成二次伤害[3],而且自体骨来源有限;异体骨移植对人体的免疫排斥反应要求较高[4];因此,骨组织工程支架成为人们解决骨缺损问题的主要研究方向。目前,常用的支架材料主要有无机材料、天然生物衍生材料、人工合成材料。而本工作所采用的掺锶β-磷酸三钙、硫酸钙以及硅胶[5]由于各自优异的性能,吸引了很多研究者的目光。

β-磷酸三钙(β-TCP)生物材料是一类重要的钙磷盐骨修复材料,它的钙磷原子比为1: 1.5,属于众多磷酸三钙晶型中的一种[6-7]。相对羟基磷灰石而言, β-磷酸三钙的溶解度是它的20~30倍[8], 因此,β-磷酸三钙支架植入体内易于发生水化作用,容易降解。同时β-磷酸三钙陶瓷支架具有降解可吸收的特性[9],降解的主要途径是体液的溶解和细胞的吞噬,其降解产物为钙磷离子[10],且降解下来的钙、磷离子能够进入人体循环系统并逐渐形成新生骨,因此,以β-磷酸三钙为基的各种组织工程支架在医学领域得到了广泛的研究。然而,β-磷酸三钙的脆性大、力学强度不够高,承受外力冲击能力差,且与体内新骨的形成速率相比,不能完美协调,无法达到理想的骨组织生物材料的要求[11]。但是有研究表明,生物材料中一些微量元素(如Mg,Sr,Zn,F,Si)的加入,可以改变支架材料的力学性能和生物学性质[12-14]。尤其是锶元素的加入可以促进成骨细胞抑制破骨细胞,同时可以调节材料的降解速率。张建设等[15]将制备出的掺铝和掺锶的β-磷酸三钙支架植入兔颌骨人工缺损区后观察相同时间下获得的降解速率,实验结果发现掺杂后β-磷酸三钙的降解速率较纯β-磷酸三钙慢,但其具有良好的生物相容性及临床应用前景。

α-硫酸钙半水化合物是使用最早且安全有效的骨组织工程支架材料[16],具有良好的力学性能、生物相容性,生物可降解性。与磷酸钙材料相比,硫酸钙材料更坚固,支撑作用更强,最重要的是硫酸钙的降解速率快,在6~9周内可完全降解[17],当其与钙磷陶瓷材料相复合时,可制备出降解速率与人体骨生长较为匹配的复合支架。

硅溶胶属于胶体溶液,无臭、无毒,分子式可表示为mSiO2·nH2O,是一种二氧化硅的凝胶体系,是由无定形的二氧化硅胶体粒子在水中均匀分散形成的,形成了粒径为几个纳米到数十个纳米的多聚硅酸分散体系,有相当大的比表面积,粒子本身也是无色透明,其表层由硅烷醇基(—Si—OH)和羟基(—OH)覆盖,内部为硅氧烷(—Si—O—Si—)网络[18-19]。硅溶胶可以很好地作为黏结剂,把硅溶胶涂覆在支架和颗粒的表层,当硅溶胶里的水分蒸发时,胶体粒子牢固地附着在物体表面,粒子间形成硅氧结合,即硅氧烷(—Si—O—Si—)网络结构黏附支架表层及颗粒之间,因此不仅可有效提高支架的力学强度,同时还可以改变多孔支架的表面微孔结构,而且大量研究表明SiO2的添加不会造成生物支架的细胞毒性[20]。与此同时,Dong[21]的实验研究表明,把硅溶胶涂覆在纳米金颗粒表面可以降低该基体材料的细胞毒性。此外,Luo等[22]的研究也进一步证明二氧化硅多孔支架具有良好的生物活性和促进成骨细胞分化的性能。

本工作首先以搅拌喷雾干燥法制备出掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合小球,再以硅溶胶为黏结剂包裹在复合小球表面,并用堆垛法在模具中制备出硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合生物支架,该支架结合了掺锶β-TCP的生物活性、成骨性和硫酸钙的快速降解性,弥补其在降解方面降解速率过慢的不足,同时利用硅胶的黏结性来制备出多孔复合支架。

1 实验材料与方法 1.1 实验原料及仪器

实验原料:实验室自制掺锶β-磷酸三钙,天津市风船化学试剂有限公司制备的无水乙醇;河北邢台双华石膏制品有限公司的二水硫酸钙;国药集团化学试剂有限公司的硅胶;国药集团化学试剂有限公司的戊二醛;实验室自制的蒸馏水;本实验自制的人体模拟体液(SBF)。

实验仪器:采用8411振筛机制备复合小球;采用实验室自制的堆垛成型模具对样品进行复合;采用SX2-12-12Z箱式电阻炉对样品进行烧结;采用HY-0230型力学性能测试仪对样品进行力学测试;采用EQUINOX55红外光谱仪对样品的化学组成进行分析;采用Quanta 2000扫描电子显微镜进行样品形貌分析;采用D/Max-Y型X射线衍射仪对样品进行物相分析。

1.2 实验过程

本实验制备硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合生物支架的具体步骤:将研磨后过200目筛的十八水合硫酸铝与硫酸钙置于高压反应釜中,处理8h,通过干燥、研磨、封装,得到α-半水硫酸钙粉末;将α-半水硫酸钙粉末与掺锶β-磷酸三钙通过搅拌喷雾干燥法制备出复合小球;再以硅溶胶为黏结剂包裹在复合小球表面,用堆垛法在模具中制备出复合支架,然后取模、干燥、烧结,制备出最终的硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合生物支架。其具体工艺流程图如图 1所示:

图 1 实验工艺流程图 Fig. 1 Flow chart of the experimental process
2 结果与讨论 2.1 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的形貌分析

图 2为本实验制备的规格为d×h=1cm×1cm的硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架,可以看出,硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架颜色为白色。因为硅溶胶无色透明,不会遮盖复合小球原本的颜色,而掺锶β-磷酸三钙、硫酸钙均为白色,故而该支架呈现白色。

图 2 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架宏观形貌图 Fig. 2 Macroscopic morphology of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP composite porous scaffolds

图 3为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的扫描电镜图。从图 3(a)中可以看出复合支架中单个颗粒的表面包裹着一层物质,其表面产生大量的孔洞和微裂纹,分析其原因在于硅溶胶涂覆在单个颗粒的表面,在模具中堆垛,利用硅溶胶的黏结性把复合小球黏结在一起形成如图 2所示的支架,在烧结处理的过程中,颗粒表面的硅溶胶会快速脱水,分散在溶液中的二氧化硅粒子会牢固地附着在物体表面,粒子间形成硅氧结合,即硅氧烷(—Si—O—Si—)网络结构黏附支架表层及颗粒之间,进而在样品表面产生一定量的微裂纹和孔洞。从图 3(b)中可以看出颗粒的内部存在大量的不规则孔洞结构,其孔径范围主要分布在50~200μm,从棒状硫酸钙的存在分析可知这些微孔主要由粉体颗粒堆垛而成。这些微孔的存在有利于营养物质交流,为细胞的黏附与增殖提供适合的生存环境。

图 3 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的扫描分析图 (a)单个颗粒的放大图;(b)高倍细节图 Fig. 3 SEM images of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP biological scaffold (a)magnified image of individual particles; (b)high magnification image
2.2 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架X射线衍射(XRD)分析

图 4分别为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙多孔复合支架和掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙复合小球的XRD图谱,与标准PDF卡片对比分析,可以看出2θ为27.831°,31.084°,34.458°处β-磷酸三钙的衍射峰和2θ为11.747°,20.843°,29.277°,33.494°处硫酸钙的衍射峰分别与β-磷酸三钙和硫酸钙的标准特征峰一致。证明了该复合支架和复合小球中存在β-磷酸三钙和硫酸钙两相,从图中可以看出硫酸钙为主相,与实验配比中掺锶β-磷酸三钙占硫酸钙30%(质量分数,下同)相一致。另外,从图中可以看出含硅胶的复合支架的XRD图谱与复合小球的XRD图谱相比,较为弥散,这主要是因为明胶为非晶相。

图 4 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架XRD图 Fig. 4 XRD patterns of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP biological scaffold
2.3 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架FT-IR分析

图 5为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙多孔复合支架的红外分析图,由图 5分析可知,在3605,3548cm-1两个吸收峰附近对应为结晶水中O—H的不对称伸缩振峰,而在1624cm-1吸收峰为表面吸附水的H—O—H弯曲振动峰,这些峰的形成主要是因为硫酸钙中结晶水的存在,以及硅溶胶中结构水的存在;1157cm-1处的宽而强的吸收峰和670cm-1处的吸收峰为SO42-的特征吸收振动峰,证明了硫酸钙的存在;3452cm-1附近的宽吸收峰为—OH的伸缩振动峰,1113cm-1和601cm-1分别为PO43-不对称伸缩振动峰和弯曲振动峰,证明了β-磷酸三钙的存在;470cm-1附近的吸收峰为SiO32-的弯曲振动峰,表明了样品中有硅酸盐的产生,而797cm-1附近吸收峰为硅氧四面体中Si—O振动峰,证明了复合后SiO2的存在。

图 5 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的红外分析图 Fig. 5 FT-IR spectra of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP biological scaffold
2.4 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的能谱(EDS)分析

从上述的XRD图谱和红外图谱中,都不能证明锶元素的存在,因此,对制备的支架进行了EDS能谱分析,结果如图 6所示。从图中可以看出,该复合生物支架中含有Ca,S,O,P,元素,结合上述XRD、红外分析可知,为CaSO4和β-磷酸三钙中的元素,同时,从图中还可以看出少量的Sr元素存在,说明掺锶β-磷酸三钙粉体中确实有锶元素的存在。另外,从图中还可以看出该支架中含有大量的Si元素,根据上述XRD、红外分析可知,它是属于硅胶里面的元素,因此证明了硅胶的存在。

图 6 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的EDS图 Fig. 6 EDS spectrum of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP biological scaffold
2.5 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的孔隙率和孔洞参数分析

图 7为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的孔径分布图,从图中可以看出该支架的主要孔径分布范围在100~800μm,其中值约为150μm,另外,通过检测得到其平均孔隙率高达62%。根据有关报道,孔径大于100μm时,可以满足细胞黏附与增殖的基本环境[23],同时有利于营养物质的传送,孔隙率达到60%可以达到骨组织工程支架对孔隙率的基本要求,由此可知该支架的孔径和孔隙率可以满足骨组织工程支架的要求。

图 7 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的孔径分布图 Fig. 7 Aperture profile of SiO2/calcium sulfate/strontium-doped β-TCP biological scaffold
2.6 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的力学性能分析

通过力学测试,本实验制备的硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙支架的平均抗压强度在0.1MPa左右,可以看出该支架的抗压强度较低。主要原因在于烧结过程中,硅溶胶里的水分蒸发,胶体粒子以硅氧烷(—Si—O—Si—)网络结构牢固地附着在支架和小球的表面,在一定程度上提高了支架的力学强度,但是烧结也使得样品表面产生一定量的微裂纹,故支架在受到外力作用时,首先使得微裂纹不断扩展,生成裂纹,降低支架力学性能,使其抗压强度达到0.1MPa左右,因此该支架只可以用于骨组织修复的非承重部位。

2.7 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的体外降解分析

图 8为复合支架浸泡于SBF溶液中的降解曲线图。从图中可以看出该支架在前4天处于增重状态,在以后的降解过程中一直失重,分析其原因主要在于前4天材料刚开始降解,SBF溶液中活性物质(如钙磷离子等)在支架上的沉积导致增重;而4天之后支架的降解速率加快,SBF溶液活性物质的沉积量小于支架降解的减少量,进而导致失重现象的产生。

图 8 复合支架浸泡于SBF溶液中的降解曲线 Fig. 8 Degradation curves of the composite scaffold in SBF

图 9为浸泡4天后的扫描电镜图,表 1为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架表面出现颗粒状物质的钙磷含量及其含量比。从图 9中,可以明显看到支架的表面新出现许多颗粒状物质,通过表 1,可以看出这些颗粒状物质的主要成分为Ca和P,其钙磷原子比约为1.65,这与沉积产生的羟基磷灰石的Ca/P一致,因此推测该支架表面的颗粒状物质中含有一定量的羟基磷灰石。分析其原因在于:该支架表面复合的SiO2在SBF溶液中发生水解,硅氧键(—O—Si—O)发生断裂,产生一定量的硅羟基团,即Si—O—H,进而形成聚硅酸,呈网状或链状结构,并带上一定量的负电荷,使得材料表面极易吸附支架材料表面溶解出的Ca2+,PO43-离子,使得材料表面Ca,P离子浓度升高达到成磷灰石的形核阈值,在材料表面生成其晶核。随后晶体生长消耗大量SBF溶液中的Ca2+,HPO42-,PO43-,在材料表面会大量形成类骨磷灰石[24]。而类骨磷灰石的生成,也证明了该支架具有一定的生物活性。

图 9 复合支架浸泡于SBF溶液中4天的SEM图 (a)低倍图;(b)高倍图 Fig. 9 SEM images of composite scaffold immersed in SBF for 4 days (a)low magnification image; (b)high magnification image
表 1 复合支架钙磷成分分析表 Table 1 Analysis of calcium and phosphorus components ofcomposite scaffold
Atom fraction of Ca/% Atom fraction of P/% Ca/P
5.08 3.07 1.65
2.8 硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的细胞毒性分析

表 2为硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架的毒性实验结果,它是用该支架的粉体制备浸提液浓度为0.05~0.4g/mL与浓度为5×104个/mL的人肾上皮细胞共培养24h后的细胞增殖度(RGR)值。细胞毒性结果表明,粉体浓度在0.05~0.40g/mL时,细胞增殖度均在95~125之间,根据国家标准GB/T14233.2-2005判定其毒性等级为0或1级。由此说明本实验所制备的硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物多孔支架粉体无细胞毒性。

表 2 支架的细胞增殖度 Table 2 Cell proliferation of scaffold
Concentnation/(g·mL-1) RGR
0.05 109.6±7.3
0.10 106.1±1.7
0.20 123.2±2.9
0.40 99.1±6.1
3 结论

(1) 通过搅拌喷雾干燥法和模具堆垛法成功制备出了具有一定抗压强度的硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架,且该制备方法简单易操作。

(2) 该硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架平均孔隙率达到62%,孔隙尺寸在0.3~1.0mm之间,孔径主要分布在50~200μm,能较好地满足骨组织生物工程对支架材料的要求。

(3) 从硅胶/掺锶β-磷酸三钙/硫酸钙生物支架的体外生物降解实验发现,在浸泡于SBF的过程中有羟基磷灰石的沉积,说明支架材料具有一定的生物活性,且该支架材料细胞毒性为0级或1级,即无细胞毒性。

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