2. 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心, 呼和浩特 010010
, XIE Mengyuan1, LI Wenhao1, ZHANG Zhidan1, WANG Xiaodan1, CHEN Kejia1, LIU Pingping1, ZHOU Weiguang1, WANG Jianlong2
, XU Xiaojing1
2. Inner Mongolia Animal Disease Control Center, Hohhot 010010, China
牛肠道微生物群是一个复杂的多微生物生态系统，在维持黏膜健康方面发挥着重要作用。黏膜微生物种群在肠道疾病发病机制中的作用已在其他物种中得到充分证实[1-3]。然而，关于在疾病条件下发生的粪便微生物群变化的信息有限，例如由病毒和细菌引起的犊牛腹泻。本研究旨在利用16S rDNA基因高通量测序技术探讨由不同病原引起的腹泻犊牛之间粪便微生物群组成的多样性及差异性，为犊牛肠道疾病的临床诊断及治疗提供理论依据，也为进一步开发益生菌资源奠定基础。
1 材料与方法 1.1 样本采集及分组选取内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗和磴口县、乌兰察布市卓资县共3个规模化养牛场的1~2月龄犊牛作为粪便采集对象，根据临床症状，腹泻犊牛发热、无力、背毛杂乱，用无菌肛拭子刺激犊牛肛门部位使其排便，用无菌采样袋采集新鲜腹泻粪样30份，健康粪样8份，干冰速冻保存。送至实验室后对每份样品进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)3种病毒及沙门菌(invA)、埃希菌属-志贺菌(ipaH)和致病性大肠杆菌(K99)3种细菌的PCR检测。其中8个腹泻粪样检测出BRV病毒定为腹泻a组(DC_a)，12个腹泻粪样检测出埃希菌属-志贺菌为腹泻b组(DC_b)，8个健康粪样为健康组(HC)。样品于－80 ℃保存。
1.2 样本DNA提取和测序按照试剂盒使用说明，采用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit试剂盒提取犊牛粪便总DNA。采用细菌16S rDNA基因的V3-V4区通用引物，上游341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和下游805R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。PCR反应体系(25 μL)：模板50 ng，上、下游引物各2.5 μL，Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL。扩增条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。送至联川生物技术有限公司，采用Illumina NovaSeq平台进行测序。
1.3 数据分析测序完成后，根据fqtrim(v0.94)，在特定的过滤条件下对原始数据进行质量过滤，以获得高质量的clean标签。使用Vsearch软件(v2.3.4)对嵌合序列进行过滤。利用DADA2进行解调，得到特征表和特征序列。然后根据SILVA(release 132)分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。采用Blast进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释。α多样性和β多样性由QIIME2计算，使用ANOVA方差分析法对α多样性数据进行检验。使用Metacyc数据库进行PICRUSt2基因预测。
2 结果 2.1 犊牛肠道菌群多样性分析2.1.1 样品序列与OTU聚类 通过对28个粪便样本进行16S rDNA基因V3-V4可变区的高通量测序，获得2 181 970条原始数据。进行高质量数据统计后，获得1 736 486条有效序列。如图 1所示，所检测序列按照97%相似度水平划分，DC_a组、DC_b组和HC组的OTUs分别为6 203、845和6 435个，其中3组共有的OTUs是123个，HC组分别与DC_a组和DC_b组的共有OTUs是1 000和171个，表明3组OTU水平均有较大差异。DC_b组OTU水平明显低于其他两组，表明DC_b组内微生物丰度小于其他两组。
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图 1 HC组、DC_a组和DC_b组肠道菌群的OTUs韦恩图 Fig. 1 Venn diagrams of OTUs of the intestinal flora of the HC, DC_a and DC_b groups |
2.1.2 α多样性分析 所检测的样本中Good’s_coverage指数均接近1(图 2)，表明检测深度足够，基本覆盖到样品中所有物种，数据合理。
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图 2 Good’s_coverage稀疏曲线 Fig. 2 Good's_coverage sparse curve |
通过Chao1、Shannon和Simpson等α多样性指数评估了肠道菌群多样性和丰度(图 3)，从结果可以看出，DC_b组的α多样性指数均显著低于DC_a组和HC组(P < 0.05)，DC_a组和HC组间差异不显著(P>0.05)。结果显示，由细菌引起的腹泻犊牛肠道菌群丰度和多样性均大幅降低。
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*. P < 0.05; ns. 差异不显著 *. P < 0.05; ns. The difference level is not significant 图 3 HC、DC_a和DC_b组犊牛肠道微生物群落多样性指数 Fig. 3 Diversity indices of the intestinal microbial communities of calves in the HC, DC_a and DC_b groups |
2.1.3 β多样性分析 PCoA分析中(图 4)，PCoA1和PCoA2这两个主成分的贡献值分别为55.61%和12.3%，正常(HC)及腹泻样品(DC_a、DC_b)能够明显区分，并且每组样品较为集中，表明所采集的样品重复性较好。
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图 4 HC、DC_a和DC_b组犊牛肠道菌群PCoA分析 Fig. 4 PCoA analysis of the intestinal flora of calves in groups HC, DC_a and DC_b |
2.2.1 门水平肠道菌群结构成分分析 以SILVA为参考数据库对特征序列进行分类学注释，本研究从28份粪便样本共注释到26个门59个纲117个目206个科263个属。从门水平对样本的OTU丰度进行物种聚类统计分析显示(图 5)，各组肠道菌群中丰度排名以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)四大菌门为主，但在各组表现均有差异，其平均丰度为：厚壁菌门(HC: 71.57%，DC_a: 81.33%，DC_b: 56.40%)、变形菌门(HC: 2.15%，DC_a: 2.77%，DC_b: 31.39%)、放线菌门(HC: 6.81%，DC_a: 1.31，DC_b: 11.44%)和拟杆菌门(HC: 17.52%，DC_a: 12.15%，DC_b: 0.57%)。其中厚壁菌门和拟杆菌门的比例被称为F/B比值，可作为评估病理状态的生物标志物。通常较低的F/B比值被认为是健康正常的肠道。各组F/B比值分别为HC组：4.09；DC_a组：6.69；DC_b组：98.95。从图 5可以看出，在检测出志贺菌的DC_b组犊牛肠道菌群中，变形菌门的丰度高达31.39%，变形菌门中包括很多病原菌，如大肠埃希菌属(Escherichia- coli)、沙门菌(Salmonella)、埃希菌属-志贺菌(Escherichia-Shigella)、梭菌(Clostridium)等可致犊牛腹泻的菌属。
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图 5 HC、DC_a和DC_b组前30菌群门水平相对丰度 Fig. 5 Relative abundance at the phylun level of the first 30 phyla of the HC, DC_a and DC_b groups |
2.2.2 属水平肠道菌群结构成分分析 从属水平进行物种聚类统计分析显示(图 6)，各组的优势菌属有较大差异，HC组排名前十的菌属为：瘤胃球菌科UCG-005菌属(Ruminococcaceae_UCG-005)；栖粪杆菌属(Faecalibacterium)；柯林斯菌属(Collinsella)；毛螺旋菌属(Lachnospiraceae_unclassified)；拟杆菌属(Bacteroides)；产粪甾醇真细菌(Eubacterium_coprostanoligenes_group)；乳杆菌属(Lactobacillus)；Muribaculaceae_unclassified；瘤胃球菌科UCG-014菌属(Ruminococcaceae_UCG-014) 及瘤胃球菌属(Ruminococcus_2)，其丰度分别为10.09%、8.16%、5.16%、4.30%、4.27%、3.70%、3.62%、2.88%、2.73%及2.52%。DC_a组排名前十的菌属为：瘤胃球菌科UCG-005菌属(Ruminococcaceae_UCG-005)、毛螺旋菌属(Lachnospiraceae_ unclassified)、克里斯滕森氏菌科R-7菌属(Christensenellaceae_R-7_group)、粪球菌属(Coprococcus_3)、理研菌科_RC9菌属(Rikenellaceae_RC9_ gut_group)、瘤胃球菌科UCG-012菌属(Ruminococcaceae_UCG-013)、产粪甾醇真细菌(Eubacterium_coprostanoligenes_group)、Family_XIII_AD3011_group、厚壁菌门(Firmicutes_unclassified)及瘤胃球菌科(Ruminococcaceae_unclassified)，丰度分别为26.91%、6.09%、5.62%、3.87%、3.38%、2.93%、2.90%、2.73%、2.71%及2.66%。DC_b组排名前十的菌属为埃希菌属-志贺菌(Escherichia-Shigella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、活泼瘤胃球菌属(Ruminococcus]_gnavus_group)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、链球菌属(Streptococcus)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)、梭菌目(Clostridiales_unclassified)、梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)及Tyzzerella_4，其丰度分别为28.36%、18.40%、10.22%、10.21%、7.76%、5.17%、2.37%、1.57%、1.23%及1.12%。数据显示健康(HC)和腹泻(DC_a、DC_b)犊牛肠道菌属OTU丰度各不相同。
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图 6 HC、DC_a和DC_b组前30菌群属水平相对丰度 Fig. 6 Relative abundance at the genus level of the first 30 genus of the HC, DC_a and DC_b groups |
通过LEfSe (line discriminant analysis (LDA) effect size)分析，以检测细菌分类群组成的变化及鉴定相对丰度存在显著差异的分类群(生物标记物)。LEfSe分析结果表明(图 7A), 根据LDA分值>4.0，在HC组鉴定了拟杆菌属(Bacteroidetes)、普雷沃氏菌属(Prevotellace-ae)、真杆菌属(Eubacterium_coprostanoligenes_group)、Muribacul-aceae菌属、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟普雷沃菌属(Alloprev-otella)等21种丰度差异显著的分类群；在DC_a组鉴定了梭菌属(Clostridia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnos-piraceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、粪球菌属(Copr-ococcus)、理研菌科(Rikenellaceae)等31种丰度差异显著的分类群；在DC_b组鉴定了γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、埃希菌属-志贺菌(Escherichia_Shigella)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、乳杆菌目(Lactobacillales)等18中丰度差异显著的分类群。
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图 7 HC、DC_a和DC_b犊牛肠道菌群LEfSe分析(A)和进化分支图(B) Fig. 7 Analysis of intestinal flora LEfSe in HC, DC_a and DC_b calves (A) and Evolutionary branching diagram (B) |
采用PICRUSt2基因预测的方法，将得到的OTUs数据以Metacyc数据库为生物代谢通路分析数据库, 预测样本的菌群代谢功能，分析差异通路。分析结果如图 8所示，与HC组相比，DC_a组在多糖、半乳糖的利用，糖的生物合成及S-腺苷-L-蛋氨酸的生物合成明显下调，DC_b组己糖醇的酵解利用、糖的酵解及L-色氨酸的生物合成上调。结果表明，肠道菌群的改变不仅影响犊牛的健康状况，还可能导致犊牛肠道菌群功能的变化。
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图 8 HC、DC_a和DC_b组犊牛肠道功能基因差异 Fig. 8 Genetic differences in intestinal function in calves of the HC, DC_a and DC_b groups |
牛肠道微生物群由多样化且复杂的微生物组成，它们在复杂的黏膜生态系统中共存，有助于维持宿主健康和促进免疫发育的作用[1]。微生物群的某些成分大量存在于健康肠道中，并且数量几乎恒定[2]，与不健康肠道中的组成丰度有一定差异。Illumina NovaSeq测序平台及相关的生物信息学分析揭示了包括牛在内的许多物种的肠道环境中微生物群落的多样性程度，并证明了宿主和微生物生态系统之间复杂的相互作用[4]。越来越多的证据表明，犊牛腹泻是由多种因素共同造成的，且犊牛腹泻后可引发繁殖能力降低、产奶量或体重减少进而导致养牛业经济损失[5-7]。本研究比较了健康犊牛和由BRV、埃希菌属-志贺菌引起的腹泻犊牛粪便微生物群的组成多样性和差异。研究结果表明，健康犊牛和由BRV、埃希菌属-志贺菌引起的腹泻犊牛之间的微生物群落组成存在显著差异。在健康犊牛和由BRV引起的腹泻犊牛中观察到的最丰富的细菌门是厚壁菌门和拟杆菌门，而在由埃希菌属-志贺菌引起的腹泻犊牛中最丰富的细菌门是厚壁菌门和变形菌门，但与另外两组相比，由埃希菌属-志贺菌引起的腹泻犊牛中厚壁菌门显著下降(P < 0.05)，含有多种病原菌的变形菌门显著上升(P < 0.05)。健康和腹泻犊牛之间的细菌在门、属上的差异证明了微生物结构的变化与犊牛腹泻的发生有关。
本研究显示，HC组犊牛中瘤胃球菌属丰度比例较高，这一分类群的成员通过产生短链脂肪酸与肠道健康广泛相关，这对于减少肠道机会性病原体的定植很重要[8]。其中瘤胃球菌科UCG-005菌属的丰度最高，瘤胃菌科UCG-005菌属参与动物体内纤维素降解和淀粉消化过程[9]。瘤胃球菌科UCG-014菌属也有较高丰度，其能够改善瘤胃中的糖代谢[10]。DC_a组中除了丰度较高的瘤胃球菌属，克里斯滕森菌科也有较高丰度，克里斯滕森菌科家族成员能够分泌3种糖苷酶，促进牧草饲料中纤维素和半纤维素的分解，提高饲料的利用效能[11]。DC_b组中埃希菌属-志贺菌大比例增加，可能是导致犊牛细菌性腹泻的主要病原。活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)在DC_b组腹泻犊牛中也有较高比例，有研究指出，在克罗恩病患者中活泼瘤胃球菌的相对丰度升高与肠道症状有很高的相关度[12]，活跃期炎症性肠病(IBD) 也通常伴随着活泼瘤胃球菌的增加[13]。所以，活泼瘤胃球菌的增加或许可以作为肠道发生炎症的指征菌群。此外，细菌物种的丰富度和多样性也被认为是衡量肠道微生物群落健康的重要指标[14]。研究结果显示，健康犊牛和腹泻犊牛之间的细菌多样性指数(Chao1、shannon和Simpson)显著下降。PCoA还揭示了三组之间微生物群落组成的差异。这些结果表明健康和腹泻犊牛之间的整体微生物群结构存在显著差异。
综上所述，厚壁菌门中含包括乳杆菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属等大量益生菌，其高丰度表现说明肠道益生菌也有较高丰度，并且从细菌的属层面也有同样表现，益生菌在维持肠道微生物平衡方面有积极作用。但大多数学者认为，益生菌对犊牛肠道积极作用的确切机制仍需进一步研究。DC_b组中有高丰度的变形菌门，其中埃希菌属-志贺菌是引起本研究中犊牛腹泻的主要病原，但其中不乏肠杆菌科和梭菌等条件致病菌，并引起犊牛肠道炎症反应。Chuang等[15]研究20头反刍前的荷斯坦奶牛发现，健康组中富集的瘤胃球菌科UCG-014菌属与粪便评分、炎性因子呈负相关；腹泻组中富集的活泼瘤胃球菌属与粪便评分、炎性因子呈正相关，与本研究表现趋势一致。本研究表明，由不同病原引起的腹泻犊牛肠道菌群结构和代谢功能存在较大的差异，厚壁菌门及放线菌门差异显著；能量及营养代谢和氨基酸代谢不当是与腹泻相关的重要因素，并且表明瘤胃球菌科的功能多样性及基于扩增子测序数据推断功能的困难[16]。
4 结论本研究结果显示，由细菌引起的犊牛腹泻肠道微生物菌群丰度和多样性均下降；健康与腹泻犊牛肠道微生物群的差异表明其与腹泻的发生相关；犊牛发生腹泻后，不仅影响肠道菌群的结构，对菌群的功能也有一定影响。
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(编辑 范子娟)